人破骨细胞刺激因子的结构生物学研究及普通变形杆菌的LAD初步晶体学研究

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(Ⅰ)破骨细胞是负责骨吸收的主要细胞。它的分化和成熟需要M-CSF(macrophage colony stimulating factor)和RANKL(receptor activator ofnuclear factor kappaB ligand)介导的信号通路网络。酪氨酸激酶Src,它参与了M-CSF和RANKL介导的信号网络,对破骨细胞的功能的发挥有重要作用。破骨细胞刺激因子(OSF)是由一个短的富含脯氨酸区域,一个SH3结构域和ankyrinrepeats组成的胞内蛋白,它可以间接地刺激破骨细胞的形成和活化。OSF在鼠中的同源蛋白SH3P2可以结合Cbl上的一段proline rich的区域并形成OSF-Cbl-Src的三蛋白复合物,说明它参与了Src和Cbl介导的信号通路。我们克隆、表达并纯化了人的OSF蛋白,并进行了晶体生长,在同一条件下获得了两种空间群的晶体,并解出了它们的结构。第一种晶型我们用多波长反常散射的方法解出了它的2.57(?)的晶体结构,它属于P212121空间群,晶胞参数为a=48.06 (?),b=56.86 (?)和c=170.12 (?),最后修正的R因子和Rfree因子分别为21.0%和28.4%。第二种晶型的结构使用分子置换法解得了1.95(?)得结构,它属于P1空间群,晶胞参数为a=28.31(?),b=57.94 (?),c=60.48 (?),α=61.75°,β=76.53°,γ=90.08°,最后修正的R因子和Rfree因子分别为17.8%和23.8%。在最后的模型中,两种晶型都含有SH3结构域和ankyrin repeats结构域,只是结构域之间的相对位置有变化。这是第一个报道的具有SH3-ANKs这样的结构域排布顺序的结构。我们发现OSF-SH3结构域尾部的配体结合区(螺旋区域)明显与其它的SH3结构域不同,暗示它与proline rich配体之间的相互作用很可能需要构象的改变,并且这个构象的变化可能是受到后面的ankyrin repeats结构域的调控的。(Ⅱ)来源于普通变形杆菌的L-氨基酸脱氨酶(LAD)可以催化多种L-氨基酸脱氨。在LAD的序列中发现存在保守的FAD结合区域,所以LAD可能是属于L-氨基酸氧化酶(LAAO)。我们构建了LAD的全长和氨基端29个残基缺失的△N29LAD质粒,表达并纯化了这两种LAD,并进行了晶体生长。我们得到了得到了△N29LAD适合衍射的晶体。我们收集了△N29LAD的一套2.9 (?)的数据,并进行了初步晶体学分析。
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