论文部分内容阅读
背景和目的曲霉是自然界中广泛存在的真菌,是引起免疫抑制患者侵袭性曲霉病(IA)的主要病原菌。IA主要发生在免疫低下患者,如急性白血病、骨髓干细胞移植、实体器官移植、恶性肿瘤化疗等。近年来的流行病学研究表明IA的发病率有逐年增多的趋势,在尸解病例中超过了念珠菌感染。本病的病死率很高,可达56.0%～88.1%。造成这种高死亡率的原因之一是IA的临床表现缺乏特殊性,传统的培养和组织病理学方法不能满足要求,其早期诊断十分困难。因此,如何提高IA的早期诊断水平已成为国内外临床工作者们共同关心的热点问题。目前研究最多也最有发展前景的是血清学方法和分子生物学方法,简称非培养诊断。为了提高实验室早期快速检测水平,本课题对血清半乳甘露聚糖抗原(GM)检测,血浆(1,3)-β-D葡聚糖(BG)检测及SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测曲霉菌DNA的三种诊断方法在IA早期诊断中的临床价值进行了研究,为临床及时合理用药提供依据。方法和结果GM检测方法与结果如下:①用双夹心酶联免疫吸附试验连续检测临床真菌感染高危患者291例,每周检测两次,共1236份血清标本。根据回顾性诊断标准,将实验对象分为确诊IA(60例)、可疑IA(64例)和排除IA(167例)三个类别。②对三组患者粒细胞减少时间、强效免疫抑制剂使用和移植物抗宿主病等危险因素分布进行比较,结果无显著性差异。③比较阳性界值分别为1.5、1.0和0.5时各项诊断指标的差异,最终确定GM检测的阳性界值为0.5时各项指标相对较理想。根据确诊IA和排除IA组的GM检测结果得出本方法(cutoff 0.5)的敏感性91.7%,特异性92.2%,阳性预测值(PPV) 80.9%,阴性预测值(NPV) 96.9%。④GM检测与传统检测方法比较发现,GM检测阳性早于痰培养、影像学诊断2～8天。⑤以GM检测阳性为起点(cutoff 0.5)对真菌感染高危患者给予伏立康唑、伊曲康唑等抗曲霉抢先治疗,病死率可减少至13.5%。采用GM检测结果指导抢先治疗可减少部分患者经验性抗真菌治疗和药物毒性。⑥血清GM水平会随着IA病情的进展而增加,也会随着抗真菌治疗有效而下降,并与预后密切相关。BG检测方法与结果如下:①采用北京金山川公司的MB-80微生物快速检测系统检测上述291例患者血浆标本BG含量,以20pg/ml为阳性界值,根据确诊IA组、确诊侵袭性真菌感染(IFI)组和排除IFI组,计算本方法对IFI的敏感性为85.6%,特异性为75.0%,PPV为73.5%,NPV为86.5%,对IA的敏感性为80.0%,特异性为75.0%,PPV为61.5%,NPV为88.2%。②以20pg/ml为BG检测的阳性界值,0.5为GM检测的阳性界值,对60例确诊IA患者和120例非IFI患者的BG和GM两种血清学检测方法进行检测比较,在60例确诊IA患者中BG或GM阳性为96.7%,而BG和GM均阳性为66.7%,在120例非IFI患者中BG或GM阴性为100%,而BG和GM均阴性为70.8%。研究结果提示联合检测可提高IA诊断的敏感性,而BG和GM均阴性可基本排除IA。③对假阳性研究结果提示使用甘露聚糖肽可导致BG检测异常增高,但GM检测结果仍为阴性。PCR检测方法与结果:①在NCBI的Genebank数据库中查找相关真菌、细菌及人类的18S rRNA、5.8S rRNA、28S rRNA以及ITSI、ITS11基因序列。通过Vector NTI 8软件进行多序列比对后,针对曲霉菌rDNA基因的转录间隔区ITSI设计引物,可特异扩增出多种曲霉菌菌株。②建立了适合临床实验室采用的简便可行的曲霉菌DNA提取方法,所获得的DNA用于普通PCR和实时荧光定量PCR分析都获得了较好的结果。③以烟曲霉为研究对象,建立利用SYBR GreenⅠ荧光定量PCR快速检测曲霉菌的技术平台。用该方法对烟曲霉孢子悬液进行检测,结果证明能很好的区分不同DNA浓度,检测灵敏度为10fg/ml。④在实验室条件下初步建立了DNA提取,定量PCR及结果分析的检测程序,并对临床血清标本进行检测评估其应用价值。研究结论根据GM检测结果,可以认为①与cutoff 1.5和cutoff 1.0相比,以cutoff 0.5为阳性界值,并作为微生物学诊断标准之一有助于早期诊断。②对高危IA感染患者的GM定量检测表明,该检测具有良好的敏感性、特异性、PPV和NPV,是一种早期诊断IA感染的手段。③血清GM阳性结果常常在临床症状和影像学诊断之前出现,有助于选择更有效的抗真菌治疗。阴性结果为进一步的诊断性检测或者选择经验性的抗曲霉菌治疗提供依据。④GM检测对于血液病或恶性肿瘤患者抢先治疗具有很好的指导意义,连续监测GM水平可判断治疗效果。根据BG检测结果,可以认为①BG检测作为一种新的诊断IFI的无创性检测手段,有较好的敏感性和特异性,可作为临床高度怀疑深部真菌感染患者初筛诊断方法。②BG与GM联合检测可提高IA诊断的敏感性,而BG和GM均阴性基本可排除IA。根据PCR检测结果,可以认为①建立了适合定量PCR检测的曲霉菌DNA提取方法,初步建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测曲霉菌感染的技术。②该方法对于未进行抗真菌治疗的高危患者IA的筛检有一定的辅助诊断价值。