研究背景和目的：黄酮类化合物广泛存在于自然界各种药用植物和水果蔬菜中，有望发展成为新一代的抗肿瘤药物。蛇葡萄素是粤蛇葡萄或显齿蛇葡萄中提取的黄酮类化合物，具有消炎解毒的功效。刘德育等采用经改进的甲醇提取、水重结晶法提取分离得到蛇葡萄素，研究发现其对酪氨酸酶活性有明显的抑制作用，进一步研究发现对小鼠B16细胞有明显的抑制作用。经过几年的一系列抗肿瘤实验，发现蛇葡萄素在体外对人白血病HL-60、K562、人鼻咽癌HK-1、人乳腺癌MCF-7等肿瘤细胞株有显著的生长抑制作用，并可以诱导肝癌Bel-7402细胞凋亡；在体内对C57BL/6小鼠B16黑色素瘤和人肺癌GLC-82裸鼠移植瘤有显著的生长抑制作用。近年又发现蛇葡萄素对牛主动脉内皮细胞的增殖、Bel-7402细胞分泌的VEGF、bFGF均有抑制作用，对裸鼠移植性Bel-7402细胞也有抑瘤作用，对HL-60有促进凋亡的作用。其他的研究者发现藏药金腰草中黄酮能诱导K562细胞凋亡，芒果甙对K562也有抑制增殖促进凋亡的作用，槲皮素及金雀异黄素可诱导K562细胞凋亡，槲皮素还具有诱导人肝癌细胞HepG2的凋亡的作用。槲皮素和蛇葡萄素结构相似，从上述的研究结果以及参考文献可以推测蛇葡萄素可能具有诱导HepG2及K562细胞凋亡的作用。因此，本课题的目的是从蛇葡萄素抑制HepG2和K562细胞生长入手，观察蛇葡萄素对两种细胞(前者是实体瘤细胞，后者是非实体瘤细胞)在抑制生长和凋亡作用中的不同，并尝试通过体内实验来观察蛇葡萄素对HepG2细胞生长抑制状况。其意义是为不同细胞对蛇葡萄素抗肿瘤敏感性和特异性奠定科学基础，同时也为蛇葡萄素早日开发奠定理论基础。 方法：1.体外实验应用MTT法测定不同浓度蛇葡萄素对HepG2和K562细胞生长的影响，计算抑制率和IC50，同时，观察是否存在时间和剂量依赖性。 应用荧光染色进行HepG2和K562细胞形态学实验，观察是否存在凋亡。采用DNA琼脂糖凝胶电泳观察药物处理后的HepG2和K562细胞DNA变化，观察有无凋亡特异性的条带出现，并观察有无时间和剂量依赖性。 通过流式细胞仪来分析HepG2和K562细胞周期和凋亡率，观察是否存在时间和剂量依赖性。 2.建立Balb/c纯系裸小鼠移植人肝癌HepG2细胞模型，分组给药，观察药物对移植肿瘤的生长抑制作用和瘤组织的超微结构变化。 结果：1.不同浓度的蛇葡萄素对HepG2细胞有不同的增殖抑制作用，且呈明显的剂量和时间依赖性关系。蛇葡萄素在体外浓度为10、20、40、80、160、320、640mg/L，处理时间为24h时，对HepG2细胞的抑制率分别为(1.58±0.83)％、(16.12±2.33)％、(31.40±2.23)％、(43.92±4.42)％、(48.62±2.66)％、(64.14±4.17)％、(70.74±4.34)％，半数抑制浓度(IC50)为167.69mg/L。其36h、48h、72h的IC50分别是126.96、94.85、89.40mg/L。 荧光显微镜观察到HepG2凋亡细胞核体积变小，染色不均匀，核内呈现浓染致密的颗粒块状荧光，有的核碎裂成两块或几块的现象，有明显的剂量依赖性。DNA琼脂糖凝胶电泳发现HepG2细胞经药物处理12h后即可见到典型的凋亡梯状条带；浓度为80、160、320mg/L处理细胞24h后均可见典型梯状条带，浓度越高，亮度越强，呈剂量依赖性；640mg/L处理72h以后DNA条带呈弥散坏死状改变。 通过流式细胞术发现不同浓度的蛇葡萄素均可诱导HepG2细胞凋亡，从5～320mg/L，凋亡率一定浓度范围(40～160mg/L)呈剂量依赖性特征，超过160mg/L凋亡率没有多大改变；浓度为640mg/L72h后主要以坏死为主。浓度为160mg/L在24h凋亡率达最高为26.19％，且见明显的sub-G1峰。 2.不同浓度的蛇葡萄素对K562细胞有不同的增殖抑制作用，且呈明显的剂量和时间依赖性关系。蛇葡萄素在体外浓度为1.25、2.5、5、10、20、40、80mg/L，处理时间为24h时，对K562细胞的抑制率分别为(8.53±1.43)％、(18.32±2.61)％、(29.50±1.42)％、(41.29±3.77)％、(53.05±4.59)％、(66.99±6.33)％、(77.08±5.21)％，半数抑制浓度(IC50)为16.87mg/L。其36h、48h、72h的IC50分别是12.18、9.09和7.78mg/L。 荧光显微镜观察到K562凋亡细胞核体积变小，染色不均匀，核内呈现浓染致密的颗粒块状荧光，有的核碎裂成两块或几块的现象，有明显的时间和剂量依赖性。DNA琼脂糖凝胶电泳发现K562细胞经药物处理6h后即可见到典型的凋亡梯状条带；浓度为10、20、40、80mg/L，处理细胞24h后均可见典型梯状条带，浓度越高，亮度越强，呈剂量依赖性；80mg/L处理48h以后DNA条带呈弥散坏死状改变。 通过流式细胞术发现不同浓度的蛇葡萄素均可诱导K562细胞凋亡，从1.25～80mg/L，凋亡率呈明显的时间和剂量依赖性特征，浓度为80mg/L48h后主要以坏死为主。浓度为40mg/L在24h凋亡率达最高为29.82％，且见明显的sub-G1峰。 3.将HepG2细胞接种Balb/c纯系裸小鼠颈背部皮下2周后，24只小鼠均有肿瘤的发生，瘤内给药15天后处死动物剥除肿瘤称重，溶剂组(6只)肿瘤0.762±0.155g，低剂量组(6只)肿瘤0.564±0.104g，中等剂量组(6只)肿瘤0.381±0.099g，高剂量组(6只)肿瘤0.226±0.054g。抑瘤率低剂量组25.98％(P＞0.05)，中等剂量组50.00％(P＜0.05)，高剂量组70.40％(P＜0.01)。 结论：1.蛇葡萄素在一定浓度范围内对人肝癌细胞HepG2细胞的增殖具有显著抑制作用(P＜0.01)，并具有时间和剂量依赖性；其24h、36h、48h、72h的IC50分别是167.69、126.96、94.85、89.40mg/L。 荧光染色凋亡细胞核出现浓染和颗粒状荧光，蛇葡萄素在体外可以诱导HepG2细胞凋亡，DNA琼脂糖凝胶电泳有特异性凋亡梯带出现，流式细胞术有明显的sub-G1峰出现，并存在时间和剂量依赖性。 2.蛇葡萄素在一定浓度范围内对人慢性粒细胞性白血病细胞K562的增殖具有显著抑制作用(P＜0.01)，并具有明显时间和剂量依赖性；其24h、36h、48h、72h的IC50分别是16.87、12.18、9.09和7.78mg/L。 蛇葡萄素在体外可以诱导K562细胞凋亡，荧光染色凋亡细胞核出现浓染和颗粒状荧光，DNA琼脂糖凝胶电泳有特异性凋亡梯带出现，流式细胞术有明显的sub-G1峰出现，并存在时间和剂量依赖性。 3.通过人肝癌细胞HepG2裸鼠移植瘤模型的建立，表明蛇葡萄素对HepG2细胞有明显的抑制作用，抑瘤率低剂量组25.98％(P＞0.05)，中等剂量组50.00％(P＜0.05)，高剂量组70.40％(P＜0.01)。