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第一部分：腹腔镜辅助治疗高位一穴肛畸形及系统性疗效评价研究背景一穴肛畸形是先天性肛门直肠畸形中最严重的一种特殊类型,表现为直肠、尿道及阴道发育不良,汇合成一共同管开口于会阴。一穴肛畸形的手术治疗一直以来都是小儿普通外科、泌尿外科领域研究热点,治疗不仅要恢复肛门、尿道及阴道正常解剖结构,还要恢复其相应功能,手术复杂、术后并发症常见,预后不良。目前腹腔镜辅助技术已广泛运用于肛门闭锁合并尿道瘘、膀胱瘘的治疗,但腹腔镜辅助治疗一穴肛畸形仍无详细的报道及系统性疗效评价。研究目的本研究通过系统地评价腹腔镜辅助肛门成形术及尿道、阴道成形术的术中情况及预后,探讨腹腔镜技术在一穴肛畸形治疗中的可行性及有效性。研究方法本研究回顾了2005.11-2015.2期间手术治疗的高位一穴肛畸形患儿26例,阴道缺如,需行肠管代阴道手术者,未纳入本研究。腹腔镜辅助肛门成形术及尿道成形-阴道成形术(LAARP组)17例,其中,2005.11-2014.6,12例患者采用传统三切口腹腔镜手术；2014.6-2015.2,5例患者采用经脐单切口手术；经腹会阴联合肛门成形术及尿道成形-阴道成形手术组(APPT组)9例。通过对比LAARP组与APPT组患儿的手术年龄、骶骨比例(SR值)、共同管长度、手术持续时间、术中出血量、术后住院时间、术后并发症、术后排便功能等指标系统地评价两组的疗效。结果26名高位一穴肛畸形患儿均手术成功,LAARP组无患儿中转开腹,术后一直接受随访,失访率为0%,随访时间1-11年,平均(4.7士2.8)年。两组患儿手术年龄、共同管长度、合并脊柱骶骨畸形情况、骶骨比例(SR)无明显差异。LAARP组手术时间(124.1±4.9)min短于APPT组(131.8±3.2) min(P<0.01), LAARP组手术出血量(10.5士2.2)ml较APPT组(16.2士2.7)ml少(P<0.01),术后住院时间LAARP组明显短于APPT组(P<0.01)。术后LAARP组有2例忠儿存在直肠粘膜脱垂,APPT组1例,无统计学差异,而APPT组有1例患儿存在切口感染,两组均无尿道阴道痿复发、肛门狭窄、尿道狭窄等并发症。排便功能对比以Krickenbeck标准评价,赋值后LAARP组总评分明显优于APPT组(p=0.047),但单独比较两组自主排便运动、便秘、污便三个方面评分值无明显统计学意义。结论腹腔镜辅助手术可运用于一穴肛畸形的治疗并可获得较为满意的疗效,且具有微创、术野清晰等独特优势。第二部分 基于全基因组外显子测序技术的“一穴肛’’畸形致病基因筛选研究背景一穴肛畸形(Persistent Cloaca, PC),即先天性肛门直肠畸形合并泄殖腔畸形,是最严重的一种先天性肛门直肠畸形,有49.4%左右的患儿合并泌尿生殖、心血管、消化及中枢神经等其他系统的发育异常,部分表现为严重多系统综合症。一穴肛畸形的发病机制及病因尚不明确,基因突变可能是导致其发病的重要致病因素,但缺乏系统的、客观的基础研究结果去解释。全基因组外显子测序(Whole-exome sequencing, WES)是指利用序列捕获技术将探针覆盖到的全基因组外显子区域DNA捕捉并富集后再进行高通量测序的基因组分析方法,主要用于识别和研究与疾病、种群进化相关的编码区域内的变异。结合大量的公共数据库提供的外显子数据,有利于更好地解释所得变异结果之间的关联和致病机理,特别适合于复杂先天性疾病的遗传致病因素筛选。研究目的本研究以中国汉族人群一穴肛畸形患者为研究对象,拟在全基因组外显子水平寻找与一穴肛畸形发病相关的基因突变。研究方法选取4例核心家系trio(编号分别为PC01/PC02/PC03/PC04)及8例独立(PC05/PC06/PC07/PC08/PC09/PC10/PC11/PC12)的中国汉族人群PC患者,完整采集数据资料。排除环境因素影响后,采集术中标本剩余及外周静脉血3-5ml,提取全基因组DNA。对上述样本进行全集因组外显子测序,所得数据采用严格的质量控制及筛选策略(1000 Genome, ESP6500及ExAC数据库等位基因频率,SIFT/PolyPhen2保守型预测等),数据分析时考虑多种显性遗传及隐性遗传模型的可能,并在KEGG,GO分析的基础上结合基因表达数据库,对数据及相关通路进行深入挖掘,以探索可能的致病突变。结果1、在显性新发突变(de novo mutation)遗传模型下,没有发现可以导致编码氨基酸改变的新发突变。2、在隐形遗传模型下,在1例一穴肛畸形(PC01)和复发性自发胚胎停育(PC01母亲)trio家系中,得到DNAH2基因的复合杂合非同义突变(p.Ser312Thr和p.Arg573Cys)和TULP4基因的复合杂合非同义突变(p.Arg490Trp和p.Pro1270Leu), DNAH2和TULP4参与初级纤毛(primary cilium)构成,与脊柱动物胚胎早期发育有关,有功能相关性。3、对12例一穴肛患儿测序数据进行罕见频发位点筛选,筛选出的34个位点分别富集于PDE4DIP、OR2T27、ANKRD36、ZNF717、HLA-DQB2、GPRIN2、 OR9G1、HYDIN、MAP2K3、KCNJ18、NPEPPS、KIR2DL1及KIR3DL1等14个基因。其中,曾有报道KIR2DL1基因与胚胎发育有关,我们将KIR2DL1基因选为候选基因,在KIR2DL1基因发现一个罕见的杂合非同义突(p.Thr91Lys/c.272C>A)该突变在3例患儿(PC03,PC09,PC10),2例患儿母亲(PC01,PC03)中均存在,考虑该突变位点可能与一穴肛畸形发病有相关性。结论DNAH2基因的复合杂合非同义突变(p.Ser312Thr和p.Arg573Cys)和TULP4基因的复合杂合非同义突变(p.Arg490Trp和p.Pro1270Leu)可能与一穴肛畸形发病、早期胚胎发育异常相关,其遗传模式可能为复杂隐形遗传；患儿母亲的非同义KIR2DL1基因突变(p.Thr91Lys/c.272C>A)可能导致胚胎蜕膜层发育异常引起胚胎发育异常及畸形形成,具体的机制仍需进一步的动物基因敲除模型证实。