海岛棉再生体系的建立及农杆菌介导转化Bt基因的研究

来源 :新疆农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:cdl872
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本研究通过对1个陆地棉品种(中棉所44)和4个海岛棉品种(新海21、24、28和33)下胚轴体细胞胚胎发生进行差异研究,探讨5个品种组织培养过程中各时期的差异,并以对新海28和新海33胚性愈伤组织为受体,通过农杆菌介导法进行Bt基因的遗传转化,对转基因植株进行PCR检测和GUS组织化学检测,初步确定外源Bt基因已整合到两个海岛棉品种基因组中,并进行了表达。本研究取得的主要成果如下:  以1个陆地棉和4个海岛棉品种的下胚轴为外植体诱导愈伤组织,采用2种MS1+0.1 mg/L2,4-D+0.1 mg/L KT和MS1+0.3 mg/L NAA+0.1 mg/L KT棉花愈伤组织诱导实验中常用的激素组合培养基进行诱导愈伤组织。实验结果表明,0.1 mg/L2,4-D+0.1 mg/L KT配比下陆地棉和海岛棉的愈伤组织出愈率高,0.3 mg/L NAA+0.1 mg/L KT配比下出愈率低而大部分愈伤组织为灰白色硬块,这种状态下愈伤组织很难诱导下面的胚性愈伤组织分化试验。因此,本实验0.1 mg/L2,4-D+0.1 mg/L KT配比为最优诱导培养基继续进行诱导试验。  愈伤组织分化到胚性愈伤组织诱导全过程中,MS2培养基里2次或3次继代培养对陆地棉和海岛棉胚性愈伤组织分化效果最佳。MS3培养基培养2~3次后的胚性愈伤组织转入到液体MS4培养基进行悬浮培养诱导体细胞胚。结果表明,5个棉花品种都适于悬浮培养诱导体细胞胚,4种海岛棉在添加激素的S1(0.1 mg/L2,4-D+0.1 mg/L KT)、S2(MS4+0.05 mg/L IBA+0.1 mg/L KT)和S3(0.3mg/L NAA+0.1 mg/L KT)培养基上体胚发生率均下降,而陆地棉体胚发生率提高及加快了再生植株发育进度,尤其在S3上。  在胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织细胞学观察比较试验中发现,海岛棉愈伤组织和胚性愈伤组织的各时期细胞比陆地棉的大。海岛棉愈伤组织的细胞大小无规律、细胞壁薄、细胞核位于细胞壁边缘并液泡大,到胚性愈伤组织和体细胞胚胎初期细胞与细胞间紧密连接,细胞大小比愈伤组织小。  以新海28和新海33胚性愈伤为受体,通过农杆菌介导的转基因技术,获得了Bt基因的转化体系,并获得了转化再生植株。转化过程中500 mg/L头孢霉素和50 mg/L卡那霉素抗性筛选在提高抗性胚性愈伤再生率和转化率中效果最佳。  通过对转基因植株进行PCR检测和GUS组织化学检测,本实验初步验证,获得了8个转基因阳性植株,且确定所转化的外源Bt基因稳定存在于转化体基因组中。
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