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疟疾是一种古老的疾病,也是世界范围内危害最严重的寄生虫病。本文以我国第一个恶性疟原虫多表位嵌合抗原M.RCAg-1(简称M312)研制中的过程工程难点为对象,解决M312分离纯化过程中不稳定的问题,建立大规模纯化M312的工艺,探索如何增强M312免疫原性,为疟疾疫苗的研制提供工程科学基础。论文的主要创新点如下:(1)发现了 M312在分离纯化中不稳定的原因并确立了对策。通过加入EDTA和咪唑作为分离纯化伴侣,成功抑制了溶液中宿主大肠杆菌蛋白酶对产物的降解,提高了分离纯化的收率。其中咪唑用于分离纯化伴侣未见报道,其保护产物的机制可能是咪唑环与金属蛋白酶发生配位螯合,与EDTA合用导致金属蛋白酶活性降低或者失活,抑制蛋白酶对M312的破坏。(2)建立了以EDTA和咪唑为分离纯化伴侣、以金属螯合层析与高效凝胶过滤层析为主干的分离纯化M312的工艺,在洁净车间批量制备了克级M312,获得了纯度大于95%的目标蛋白,总收率约为600 mg/L培养基。批量制备的M312内毒素残留、宿主蛋白残留和DNA残留都符合美国FDA标准。质谱显示其分子量与理论值一致,圆二色光谱表征其二级结构主要是无规卷曲。与弗氏佐剂配伍免疫小鼠能产生大量的抗原特异性抗体。此外,纯化的M312能够在4℃稳定存放超过6个月。(3)尝试了一种增强M312免疫原性的新策略。将M312与截短的鞭毛蛋白(tFL)共价连接,利用M312上有游离半胱氨酸的特点,通过简单温和的SC-PEG-MAL介导的反应,实现了两个蛋白质的偶联。偶联产物M312-PEG-tFL与残留的修饰剂通过一步离子交换层析实现彼此分离,残留的原蛋白通过一步高效凝胶过滤层析移去。SDS-PAGE显示产物纯度约90%,其中单价偶联物的含量约为50%。圆二色光谱显示偶联产物基本保留了两种原蛋白的高级结构。免疫原性评价显示相比于原始的M312抗原,与tFL交联后的抗原产生了更强的体液免疫应答,并产生大量的特异性抗体。交联产物能够在小鼠中诱导脾细胞产生高程度增殖水平,促进淋巴细胞增殖,并产生大量的记忆T细胞。血清中抗体分型和脾细胞分泌的细胞因子分析发现,单独的M312更倾向于Th2型细胞免疫,而与tFL交联后能够促使Thl型细胞免疫。此外,M312-P5k-tFL使小鼠脾细胞产生更多的TNF-a,表明固有免疫应答更有效,同时tFL保留了 TLR5的活性。