心肌肥大是一种很常见的心脏疾病,是心肌细胞对多种病理刺激的一种适应性反应,为了使机体适应病理环境,心肌细胞采用代偿性肥大来保持心输出量和组织灌注量平衡,但是心肌的肥大反应如果长期得不到抑制或者缓解,最终会导致心室扩张,收缩性功能异常,最终转向心力衰竭,从而增加心脏病的发病率和死亡率。因此心肌肥大的发病原理许多年来一直是心血管疾病研究领域的热点,近年来尽管对于心肌肥大发生的研究已取得进展,但是其分子机制远未阐明,研究清楚心肌肥大发生的相关分子机制,寻找有效的防治方法,是目前基础研究和临床实践亟待解决的重大课题之一。为了阐明心肌肥大发生的分子机制,本论文选取在心脏有高表达的基因作为研究对象,探究这些心脏高表达基因在心肌肥大中的作用。首先通过左旋甲状腺素(Levothyroxine, L-THY)或异丙肾上腺素(Isoprenaline, ISO)刺激BALB/c小鼠,建立病理性心肌肥大小鼠模型,提取小鼠模型和正常小鼠心脏组织,在mRNA水平上筛选有表达差异的基因作为候选基因。在筛选中我们发现在心肌肥大小鼠模型心脏组织中,心脏高表达基因KLHL31和hole的表达明显上调。KLHL31基因是一个仅在人类心脏组织和骨骼肌中高表达的基因,其编码的蛋白质含有保守的BTB结构域和串连重复的Kelch结构域。最近的研究表达KLHL31基因对骨骼肌的分化有重要影响,而在成体心脏中的作用研究还是一片空白。本文利用分离的原代新生大鼠心肌细胞研究KLHL31基因与心肌肥大发生的关系。用胎牛血清刺激新生大鼠心肌细胞,细胞发生肥大,而KLHL31的表达也明显上调。为了进一步探究KLHL31是否与心肌肥大有关,我们利用大鼠心肌细胞系H9c2,分别构建KLHL31的真核表达载体的过表达系和pSUPER系统的干扰系。RT-PCR检测发现在过表达系中,肥大标记基因的mRNA有明显上调,而在干扰系中,肥大标记基因的mRNA有明显下调。这些结果暗示KLHL31基因可能促进心肌肥大的发生。通过生物信息学对KLHL31的启动子分析发现,在KLHL31的启动子区域含有血清应答因子(serum responsefactor, SRF)的结合位点CArG。近年来的研究证明,SRF是与心肌肥大发生相关的转录因子,许多刺激信号通过激活SRF而诱发心肌肥大的发生。KLHL31是否也是通过与SRF相结合来调控心肌肥大的发生呢?首先,我们以人基因组DNA为模板,进行PCR扩增,克隆了人KLHL31启动子中含有SRF结合位点的区域,构建pGL4.1-KLHL31荧光报告重组载体。利用荧光素酶分析该启动子具有很强的荧光素酶活性。当重组载体pGL4.1-KLHL31与SRF质粒共转染时,荧光素酶的活性明显下降。这个结果暗示SRF蛋白可能与KLHL31的启动子相结合,并影响KLHL31的转录活性；然后利用凝胶迁移阻滞试验(Electrophore-tic mobility shift assay, EMSA)进一步证明SRF能与KLHL31启动子区域中的CArG位点相结合。另外,KLHL31的表达激活内源性SRF的表达。以上实验结果表明KLHL31基因可能是通过与SRF相结合进而调控心肌肥大的发生。hole基因是我们在寻找与心脏发育相关的基因时克隆的新基因,它具有高度的进化保守性,从果蝇、线虫等低等动物到斑马鱼、爪蟾以及高等脊椎动物鸡、小鼠等动物中都存在hole基因,在进化上形成了一个独立的家族,但hole基因的功能尚不清楚。人类hole基因位于14号染色体,转录1.5 kb的mRNA,编码319个氨基酸残基,在心脏组织有较高的表达。hole蛋白没有功能性的结构域,对hole蛋白的序列分析发现该蛋白具有ERK的结合位点(D-domain),和结合SH3结构域的多聚脯氨酸序列。为了进一步探究hole基因是否与心肌肥大有关,我们利用大鼠心肌细胞系H9c2,分别构建hole的真核表达载体的过表达系和pSUPER系统的干扰系。RT-PCR检测发现在过表达系中,肥大标记基因的mRNA有明显下调,而在干扰系中,肥大标记基因的表达没有明显差异。这些结果暗示hole基因可能抑制心肌肥大的发生。荧光素酶的活性分析表明hole蛋白强烈抑制与心肌肥大相关的信号分子ANT和NFAT的转录活性。hole蛋白是否通过其ERK的结合位点(D-domain)或其C端的多聚脯氨酸序列来调控心肌肥大的发生呢?我们利用酶切方法和环状诱变方法将重组真核表达质粒pCMV-2B-hole的野生型基因进行突变得到4个截短突变体和3个定点突变体。4个截短突变体为即：单纯带有ERK结合区(DD)和DD区突变的突变体pCMV-tag2B-DD和pCMV-tag2B-MD,含有跨膜区域与ERK结合区(DD)的突变体pCMV-tag2B-TD,以及含有C’端的多聚脯氨酸序列(PP)的突变体pCMV-tag2B-PP;3个定点突变体,即仅突变ERK结合区(DD)位点的突变体pCMV-tag2B-hole-MD;仅突变多聚脯氨酸序列(PP)的突变体pCMV-tag2B-hole-MP; ERK结合区(DD)和多聚脯氨酸序列(PP)均发生突变的突变体pCMV-tag2B-hole-MPD。将构建好的突变体质粒和野生型质粒分别转染HEK293细胞,通过荧光素报告系统分析,检测心肌肥大信号分子的转录的活性,发现ERK D-domain的结合位点对hole蛋白抑制心肌肥大信号分子的转录活性的作用中起着重要作用。为了验证KLHL31和hole基因在动物体内与心肌肥大的关系,我们通过尾静脉注射方法对BALB/c小鼠进行质粒的体内转染实验。质粒转染的第二天,按照原来的方法进行ISO刺激,观察注射质粒后小鼠出现心肌肥大的情况。通过最初的心脏／体重比发现,注射KLHL31质粒的小鼠再进行ISO刺激后,较空载体质粒注射的同样进行ISO刺激的正常组小鼠的心脏／体重比的显著增大。RT-PCR检测发现,心肌肥大的标记基因也明显上调。而注射hole质粒的小鼠再进行ISO刺激后,较空载体质粒注射的同样进行ISO刺激的正常组小鼠的心脏／体重比显著减小,RT-PCR检测发现,心肌肥大的标记基因也明显下调。这些结果与前面细胞模型中的结果是相吻合的。最后,我们用一组病理性肥大型心肌病的病人心脏样本研究KLHL31和hole是否与人类病理性心肌肥大有关。结果显示,KLHL31和hole在病理性肥大型心肌病的病人心脏样本中的表达上调,与在小鼠和细胞模型中的结果相同,表明KLHL31和hole基因不仅在小鼠体内调控心肌肥大的发生,在人类心脏中可能也起着同样的作用。