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目的:Ribozyme和DNAzyme具有水解mRNA分子的功能,是阻断基因表达和抗病毒的重要工具。Ribozyme和DNAzyme研究中有两个技术关键。一个是Ribozyme和DNAzyme的作用效果问题,Ribozyme和DNAzyme的作用效果与mRNA的高级结构有关,即与作用靶点(target site)的可及性(accessibility)有关;另一个是Ribozyme和DNAzyme的递送(delivery)效率问题,高效的递送是Ribozyme和DNAzyme发挥作用的前提保证。疾病的基因治疗需要安全、高效、靶向性的分子载体。pRNA是从枯草杆菌分离得到的大小在30nm左右的小RNA分子(如图22),极易穿过细胞膜,它既具备核酸的结构特性,也具有类似蛋白质的功能,能被设计成一种理想的非病毒型载体。pRNA分子载体具有安全、高效的特性,能够较长时间的作用于效应细胞,同时不会引起免疫反应和排斥现象,是基因治疗中非常有发展前景的理想的分子载体[1]。本实验通过构建CTLA4干预分子pRNA-Ribozyme,旨在重启T细胞激活和增殖;为放射性细胞免疫低下寻求免疫调节新方案。方法:首先扩增和克隆出CTLA4基因,体外转录RNA,采用RASS方法筛选CTLA4-mRNA的可及靶点并验证其有效性,然后确定Ribozyme的作用靶点,针对靶点设计并构建制备CTLA4-pRNA-Ribozyme的DNA质粒,制备CTLA4-pRNA-Ribozyme分子,在体外分析其切割活性,比较分析其优劣。pRNA携带效应分子Ribozyme具有明确的靶向性、主动识别结合和剪切基因RNA,但由于100nt以上的RNA分子化学合成较为困难,本实验采用分子生物学方法通过基因重组构建并制备170nt的pRNA-Ribozyme。依据pRNA序列和Ribozyme分子序列,采用PCR扩增和克隆重组,将pRNA-Ribozyme按照顺式连接开放式结构、和Ribozyme嵌入pRNA成封闭型内环结构,制备DNA质粒;再在体外转录制备pRNA-Ribozyme分子。结果:从小鼠脾脏扩增CTLA-4全基因、构建其克隆,采用RASS方法筛选获得了CTLA-4的mRNA靶点,验证了3个靶点有效;对有效靶点构建了pRNA-Rz分子、及其克隆;同时采用二种方式体外制备出了pRNA-Ribozyme分子并形成聚合体结构。重组制备的pRNA-Ribozyme通过pRNA载体可以被准确运输到作用靶点,即主动进入细胞、主动识别、主动切割mRNA,阻断CTLA-4基因表达,从而发挥Ribozyme的功能。体外制备出了特异高效的CTLA4-pRNA-Ribozyme。结论:获得小鼠CTLA-4全基因序列、并构建了基因克隆,筛选获得了CTLA-4的mRNA靶点3个靶点有效;对有效靶点构建了pRNA-Rz分子、及其克隆;体外生物合成制备出了pRNA-Ribozyme顺式连接开放式结构、和Ribozyme嵌入pRNA成封闭型内环结构pRNA-Ribozyme,并且对CTLA-4基因表达的抑制作用体外实验比较明显,体外生物合成制备的CTLA4-pRNA-Ribozyme的DNA质粒,为在细胞内表达提供了基础。