论文部分内容阅读
阿尔茨海默病（Alzheimer,s disease, AD）是一种进行性记忆丧失和痴呆为特征的神经退行性疾病。其主要病理学特征是脑内神经细胞之间出现大量的β淀粉样纤维（AβPeptide ,Aβ）沉积,形成老年斑（senile plaques, SP）。神经细胞内出现神经纤维缠结（neurofibrillary tangles,NFT）。该病的最主要病因及病理机制至今仍不明了,但大量研究显示,Aβ寡聚体在AD的发展过程中起着至关重要的作用,因此针对Aβ寡聚体的免疫治疗对AD存在着潜在的治疗效果。目的:在针对Aβ寡聚体的免疫治疗中,经济、高效、便捷的制备Aβ寡聚体是实验的前提和基础。本课题组通过在原核细胞上成功表达得到Aβ1-42多肽,经鳌合层析纯化后用此多肽来研究Aβ寡聚体形成的条件和方法。为利用Aβ寡聚体制备单抗的AD免疫疗法提供经济有效的原料,从而在AD的免疫治疗方法中探索一条新的路径。同时对两个均含有Aβ1-42多肽片段的不同质粒用相同的方法进行原核表达和重组蛋白的纯化,对比两者的异同点,以筛选出更加合适的Aβ1-42多肽表达质粒。方法:构建含有Aβ1-42多肽的PET30a质粒,将其转入表达菌株BL21中进行表达,并用Ni-NTA Superflow鳌合层析柱对重组蛋白在尿素变性条件下进行纯化,得到一定浓度的Aβ1-42多肽。将纯化后的Aβ1-42多肽经六氟异丙醇（HFIP）、二甲基亚砜（DMSO）和F12培养基逐步溶解,设置不同条件摸索Aβ1-42-F12溶液形成寡聚体的规律,并与其他方法进行对比,从而初步探索出Aβ寡聚体制备的方法和条件。结果:经过多种条件的反复试验,实现了重组蛋白的高效表达和纯化。并且有与Aβ1-42多肽相同的分子量和免疫学活性。用此多肽进一步摸索出寡聚体的形成规律,一定浓度37℃的条件下,在取样第三到四天随着单体的减少,寡聚体逐渐形成,并随时间推移而呈现增多趋势。