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高致病性猪繁殖与呼吸综合征(Highly Pathogenetic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,HP-PRRSV)是PRRSV经过突变形成的具有更强致病性的毒株,能够引起猪的高热症状,怀孕母猪发生流产、早产、死胎等繁殖障碍,新生仔猪和育肥猪出现呼吸道疾病且生长缓慢。病毒或细菌等病原微生物与巨噬细胞表面的受体结合以后,与受体发生相互作用,并刺激巨噬细胞等分泌I型干扰素(interferon,IFN)和抗病毒细胞因子,其中IFN-beta(IFN-β)是在病毒感染过程中具有重要作用的I型IFN的成员之一。但是某些病毒或细菌被巨噬细胞吞噬后不仅不被降解,反而抑制宿主分泌IFN-β等天然免疫应答反应,在巨噬细胞等免疫细胞中感染和增殖,HP-PRRSV就是典型的代表。HP-PRRSV感染抑制宿主的I型IFN介导的天然免疫应答反应,例如抑制IFN-β的表达,然而HP-PRRSV对宿主的天然免疫应答反应的抑制(如IFN-β的表达)及其机理还不十分清楚。本文主要是通过分析MARC-145和猪肺泡巨噬细胞(Porcine alveolar macrophages,PAM)免疫调控通路RIG-I中重要基因IRF3、CBP等在HP-PRRSV感染前后表达水平及其定位等特征,探讨PRRSV受体基因变异对PRRSV感染的影响,研究HP-PRRSV抑制宿主的IFN-β表达的机制。主要结果如下:(1)HP-PRRSV感染抑制MARC-145细胞中的IFN-β的mRNA表达水平。感染(+HP-PRRSV)的MARC-145细胞中的IFN-β的表达量在检测的5个时间点(1hpi,12 hpi,24 hpi,36 hpi,48 hpi)均低于非感染的对照组(-HP-PRRSV)细胞的表达,同时也发现感染(+HP-PRRSV)和非感染的对照组(-HP-PRRSV)中的IFN-β的表达量非常微弱,无法有效的反映其变化趋势和不利于后期研究。为了更有效地开展研究,利用常用的IFN的刺激剂Poly(I:C)处理MARC-145细胞后,IFN-β的表达量显著增加。然而,Poly(I:C)刺激和提高的IFN-β的表达水平同样被HP-PRRSV显著抑制,而且在MARC-145细胞(Poly(I:C)+HP-PRRSV)中IFN-β的表达量变化趋势与感染的(+HP-PRRSV)MARC-145细胞中的相似。因此,采用Poly(I:C)处理的MARC-145细胞作为对照组,Poly(I:C)和HP-PRRSV处理的MARC-145细胞作为试验组开展后续研究。试验组(Poly(I:C)+HP-PRRSV)MARC-145细胞的ifn-β的表达量显著低于对照组(poly(i:c))。因此后期的试验侧重于研究hp-prrsv对ifn-β表达的抑制机理。(2)hp-prrsv感染抑制marc-145细胞中的ifn-β蛋白表达量。检测了试验组(poly(i:c)+hp-prrsv)和对照组(poly(i:c))marc-145细胞的ifn-β的蛋白表达量,结果和(1)中的ifn-β的mrna表达量的趋势一致。(3)hp-prrsv感染抑制肺泡巨噬细胞(pam)ifn-β的mrna和蛋白表达。进一步检测试验组和对照组prrsv自然感染的猪肺泡巨噬细胞pam(porcinealveolarmacrophages)的ifn-β表达,pam细胞中ifn-β的mrna和蛋白表达趋势一致,而且pam与marc-145细胞的结果一致。(4)hp-prrsv感染抑制ifn-β的重要调控因子irf3的表达。在marc-145细胞与pam细胞中,分别检测了试验组和对照组的irf3的mrna、总蛋白的表达量,试验组的表达量均低于对照组,而且irf3的mrna、总蛋白的表达的趋势一致。(5)hp-prrsv感染抑制irf3的核转位。在marc-145细胞与pam细胞中,进一步检测了试验组和对照组的细胞质和细胞核的irf3的表达量。结果表明,试验组的细胞质和细胞核的irf3都分别低于对照组,而且试验组细胞核的irf3蛋白非常少以致无法检测。推测hp-prrsv感染能够减少irf3由胞质向核转移的数量。(6)hp-prrsv感染抑制irf3的磷酸化。在marc-145细胞与pam细胞中,检测了试验组和对照组的irf3的磷酸化蛋白的表达量,试验组的表达量均低于对照组。推测hp-prrsv感染通过抑制irf3蛋白的磷酸化来抑制irf3的核转位。(7)hp-prrsv感染抑制irf3蛋白ser396位点的磷酸化。生物信息学对irf3的蛋白结构和功能预测表明,ser396隐蔽在irf3蛋白的螺旋结构和卷曲结构的交界处,而且已经有研究表明该位点对irf3磷酸化具有重要作用,因此推测hp-prrsv感染通过抑制ser396位点暴露来抑制irf3磷酸化。(8)hp-prrsv感染对环磷酸腺苷应答元件结合蛋白(cbp)表达没有显著影响。irf3进入细胞核通过与cbp结合形成复合物才能与ifn-β的启动子结合,促进ifn-β表达。marc-145细胞与pam细胞中的感染试验组和对照组的cbp的mrna表达量均没有明显差异,推测hp-prrsv感染对cbp的表达没有显著影响。(9)PAM细胞膜的PRRSV受体基因变异对HP-PRRSV感染的风险具有重要影响。HP-PRRSV感染的风险性与CD163和CD169的单核苷酸突变(SNP)相关。HP-PRRSV被细胞表面的受体识别并吞噬后才能进入细胞,CD163和CD169是两种重要的受体。Logistic回归方法对524头猪(康复猪n=298,患病猪n=95,死亡猪n=41,健康猪n=90)共6个SNPs的基因型进行感染风险分析,共得到3种基因型与HP-PRRSV感染相关,包括CD169–C1654A的AA基因型、CD169–C4175T的CT基因型、CD163–A2552G的AA基因型,比其它的基因型感染HP-PRRSV的风险小一些。说明具有吞噬功能的CD163和CD169的SNPs与感染HP-PRRSV的风险性有关。(10)受体CD169和CD163基因的单核苷酸突变影响受体介导的吞噬功能。蛋白结构和功能预测软件分析结果表明,CD169受体的3个SNPs均能导致氨基酸的改变,而且都位于免疫球蛋白区域,影响蛋白稳定性。这3个SNPs通过改变蛋白稳定性来影响受体介导的吞噬功能。CD163受体的2个SNPs位于结合病原体的结构域,虽然不改变氨基酸,但是通过影响密码子的偏好性进而改变翻译的蛋白的数量。另一个SNP也位于结合病原体的结构域,通过改变氨基酸影响受体的吞噬功能。本研究初步认为HP-PRRSV通过影响IRF3二级和三级结构而降低了IRF3的磷酸化水平,IRF3蛋白的较低磷酸化水平影响和降低了IRF3进入细胞核的数量,减少了蛋白IRF3和CBP结合形成的复合物,并且减少了复合物与IFN-β启动子结合机会,从而抑制IFN-β的转录和蛋白表达,进而使HP-PRRSV抑制了宿主的免疫反应而感染侵害宿主。此外,PAM细胞膜上的PPRSV受体基因(CD163和CD169)的变异和不同基因型也影响HP-PRRSV感染风险性。