青藏高原具有上千年历史的传统发酵牦牛酸奶中蕴藏着丰富的乳酸菌,是我国极端环境条件下的宝贵而特有的乳酸菌种质资源。而极端环境下产生的生物遗传变异和适应机制又为筛选功能乳酸菌提供了一个很好的特异性基因库。但是目前对青藏高原整个地区牦牛酸奶中乳酸菌多样性的研究仍然是个空白,而针对青藏高原乳酸菌开展系统性的益生特性研究也鲜有报道。为了更好地揭示并开发利用我国极端环境条件下优质乳酸菌资源,挖掘出具有潜在益生特性的功能乳酸菌,本试验根据青藏高原牦牛主要分布区域,集中采集了青藏高原祁连青东高山盆地针叶林、草原区,果洛那曲高原山地高寒灌丛草甸区,羌塘高原湖盆高寒草原区、藏东高山深谷针叶林区和藏南高山谷地灌丛草原区等5个生态地理区的牦牛酸奶样品,采集地点海拔高度为2612m～4977m,纬度为30°03’9.12"～37°52’42.61",经度为87°13’15.71"～102°56’12",地域跨度从青藏高原东北缘祁连县至西部阿里地区尼玛县。共17个县,55个地区,241份牦牛酸奶样品。通过传统分离培养并结合高通量测序以及宏基因组、代谢组等技术手段,对青藏高原传统发酵牦牛酸奶中乳酸菌多样性及其抗氧化、降胆固醇与产胞外多糖等益生特性进行了研究。主要结果如下：1.多样性。传统培养法结合高通量测序结果表明,青藏高原传统发酵牦牛酸奶中乳酸菌主要有乳酸杆菌属(Lactobacillus),链球菌属(Streptococcus),肠球菌属(Enterococcus),明串珠菌属(Leuconostoc),魏斯氏菌属(Weissella),乳球菌属(Lactococcus)和片球菌属(Pediococcus)等7个属。其中乳酸杆菌属和链球菌属的基因序列相对丰度占酸奶中所有微生物的98.5%～99.7%,而且酸奶中这两种微生物的比例在不同植被生态区各有差异。同时,研究结果表明牦牛酸奶中共分离鉴定出17个乳酸菌菌种或亚种；乳杆菌属乳酸菌主要有植物乳杆菌(L. plantarum),戊糖乳杆菌(L. pentosus),德氏乳杆菌(L. delbrueckii),副干酪/干酪乳杆菌(L. paracasei),瑞士乳杆菌(L. helveticus)、短乳杆菌(L. brevis)和发酵乳杆菌(L.fermentum),其中植物乳杆菌,戊糖乳杆菌和德氏乳杆菌为主要的乳酸杆菌；而链球菌属乳酸菌仅鉴定到嗜热链球菌(S. thermophilus)、马其顿链球菌(S. macedonicus)和唾液链球菌(S. salivarius)。就牦牛酸奶中所有微生物种类而言,气候环境相对温和、湿润的藏东高山深谷针叶林区所采集牦牛酸奶中微生物的种类在5类植被生态区中最多(含29个属)。除了藏南灌丛谷底草原区(9个属),在气候相对寒冷和海拔较高的羌塘盆湖高寒草原区酸奶中微生物的种类最少(15个属)。酸奶中的醋杆菌属(Acetobacter)细菌的数量从青藏高原东麓的祁连高山盆地针叶林地草原区至阿里地区羌塘盆湖高寒草原区依次减少。另外,青藏高原传统发酵牦牛酸奶中含有少量的葡萄球菌(Staphylococcus)、肠球菌、链球菌、不动杆菌(Acinetobacter)和无色杆菌(Achromobacter)等属的致病菌种。纬度和pH与微生物多样性显著相关,而海拔和经度与酸奶中微生物的多样性没有相关性。2.降胆固醇乳酸菌及其益生作用。从牦牛酸奶中所筛选的降胆固醇植物乳杆菌菌株对SD大鼠具有明显的益生作用。降胆固醇乳酸菌能够显著降低饲喂高脂日粮大鼠血清中胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白的含量,并提高了血清瘦素和胰岛素的含量(P<0.05)。通过分析SD大鼠盲肠微生物宏基因组序列得出,饲喂高脂日粮SD大鼠盲肠内厚壁菌门微生物的数量比饲喂普通日量的大鼠明显增多(16S rRNA基因序列相对丰度76.66%vs.96.53%)；同时,拟杆菌门微生物的数量明显降低(20.16%vs.1.6%)。而降胆固醇乳酸菌植物乳杆菌可使大鼠盲肠微生物中厚壁菌门数量明显减少(86.29%vs.96.53%),拟杆菌门明显增加(11.93%vs.1.6%)；同时,可显著降低采食高脂日粮大鼠盲肠内毛螺旋菌科和丹毒菌科微生物的数量,提高瘤胃菌科微生物的数量,并降低了链球菌科和梭菌目未知科微生物数量。说明乳酸菌可改善饲喂高脂日粮大鼠肠道微生物的群落组成。同时,乳酸菌显著提高了高脂日粮模型大鼠盲肠生物的多样性指数(diversity index; P<0.05)。通过分析SD大鼠盲肠代谢组,饲喂高脂日粮的SD大鼠其盲肠内具有特异的代谢产物,如脂肪酸代谢产物、与胆汁酸合成和分泌相关的代谢产物以及尿胆素等物质,而且这些物质的含量明显高于饲喂普通日粮组的SD大鼠。与饲喂高脂日粮的SD大鼠相比,饲喂高脂日粮+降胆固醇植物乳杆菌的SD大鼠其盲肠内特异性的代谢产物主要为参与类固醇生物合成的物质。3.抗氧化乳酸菌及其益生作用。牦牛酸奶中筛选出的乳酸菌无细胞提取物具有较强的综合抗氧化能力,尤其表现极强的HO·清除能力,所有分离菌株清除率都>40%。大部分表现较强的亮氨酸芳氨酶、缬氨酸芳氨酶、β半乳糖苷酶和β葡萄糖苷酶的活性,其中分离的两株保加利亚乳杆菌酶活表现最强。所有菌株具有极强的金黄色葡萄球菌和李斯特氏菌抑制能力,以及对消化道环境的耐受能力。德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株F17从抗氧化能力以及体外益生特性评价中分析,综合表现较好,且具有产细菌素的能力。小鼠体内试验结果表明,F17可有效减少D-半乳糖对脑组织的损伤,其效果优于3mg/只／天剂量的Vc。另外,该菌株可显著增加小鼠肠道内双歧杆菌和肠球菌(B/E)比值(P<0.05),调节肠道微生物菌群,提高小鼠肝脏和血清中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性,血清和脑中总超氧化物歧化酶(T-SOD)的活性,以及降低小鼠血清中丙二醛(MDA)的含量(P<0.05)。4.产胞外多糖(EPS)乳酸菌及其益生作用。分离出的一株乳明串珠H52在没有优化条件下EPS产量为304.86mg/L,且该菌株表现较强的亮氨酸芳氨酶、缬氨酸芳氨酶、β-半乳糖苷酶和β葡萄糖苷酶活性。在所有分离菌株中H52抑菌能力最强,对鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium, CICC10420)、单增李斯特氏菌(Listeria monocytogenes, CICC21583)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, CICC10384)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli, CICC20234)都表现极强的抑制能力。体外益生特性试验中,H52具备作为益生菌的基本条件。小鼠体内试验表明,F17和H52可以显著提高血清中细胞因子IL-10和IL-12的含量(P<0.01)。F17在诱导血清中IFN-γ的产生中有明显的效果,优于H52。本试验首次全面地收集和保存了青藏高原牦牛酸奶乳酸菌种质资源,并揭示了其多样性以及多样性与生态环境之间的相关关系。同时,通过体外筛选和老鼠体内模型试验并结合肠道微生物宏基因组和代谢组等系统地评价了分离菌株的益生特性,为青藏高原极端环境条件下的传统发酵牦牛酸奶中乳酸菌种质资源的开发利用提供了重要的科学依据和理论支撑。