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背景高等动物的大脑皮层是一个由多层神经细胞构成的、高度复杂而有序的复合体,它的形成是神经细胞由内及外的装配过程,这个过程受到严格的调控以确保建立正确的、有功能的大脑皮层。有研究表明,通过条件型基因敲除技术在小鼠胚胎时敲除N-Cadherin基因,会导致大脑皮层出现分层混乱,完全失去正常的层结构,这说明N-Cadherin在皮层发育中有着不可替代的作用。小鼠子宫内电转基因技术是近年来发展起来的在活体内研究基因功能的重要方法,特别适用于中枢神经系统基因功能研究。目的建立小鼠活体子宫内电转基因方法,利用该方法结合RNA干扰技术研究N-Cadherin在小鼠大脑皮层形成过程中对神经元迁移的影响。方法1.小鼠活体子宫内电转基因：取怀孕15d的小鼠,以合适的电转条件对胎鼠大脑皮层室管膜进行定时定位活体电转基因,电转后24h取阳性胎脑,4%多聚甲醛固定,包埋后冷冻冠状切片,DAPI染细胞核观察组织形态结构变化,荧光免疫组织化学法检测α-SMA的表达差异。2.活体电转报告基因质粒的选择：通过小鼠子宫内电转基因技术将pCAGGS-GFP, pEGFP-N1和pCL-GFP三种质粒转染到E15胎鼠的大脑皮层室管膜,通过统计三种质粒表达的荧光强度,筛选一个在活体表达荧光最强的质粒作为报告基因质粒；进一步将筛选出的质粒以不同浓度做电转比较,确定用于后续实验的合适浓度。3. N-Cadherin异常表达质粒(超表达质粒和RNA干扰质粒)的构建与验证：对购自Addgene的小鼠N-Cadherin超表达质粒进行测序,分析质粒结构；小鼠N-Cadherin的RNA干扰质粒,首先通过在线设计干扰片段,然后交由公司合成构建；将异常表达质粒转染HEK293T细胞后,应用免疫荧光及Western blotting检测N-Cadherin表达量的变化,以此验证质粒表达的效率和强度。4.通过小鼠活体子宫电转基因技术和RNA干扰技术相结合,在小鼠胚胎大脑皮层发育过程中实现对N-Cadherin的超表达和抑制表达,应用GFP示踪N-Cadherin超表达和抑制表达后神经元在大脑皮层发育过程中的迁移特征。5.为了研究N-Cadherin是否对干细胞向神经细胞分化具有重要作用,本研究将培养至第六代小鼠脂肪间充质干细胞诱导成为类神经细胞,应用RT-PCR检测诱导后N-Cadherin及其相关蛋白β-catenin、ADAM17、ADAM9等的表达变化。结果1.通过对各种转染条件的探索,成功建立了小鼠子宫内电转基因方法。GFP阳性表达胚胎的脑组织切片,显示GFP转染和正常区域的组织形态结构和a-SMA表达无显著差别。2.通过三种质粒pCAGGS-GFP、pEGFP-N1和pCL-GFP在活体表达GFP荧光强度进行比较,发现相同摩尔浓度下pCAGGS-GFP在小鼠大脑皮层的荧光表达最强；其作为报告基因的适合浓度为0.25μg/μL～0.5μg/μL。3.小鼠N-Cadherin的超表达质粒pEGFP-N-Cad转染HEK293T细胞后,细胞免疫荧光及Western blotting的结果表明,pEGFP-N-Cad能够实现小鼠N-Cadherin的超表达；同时由公司构建的两个干扰质粒N-Cad-shRNA1和shRNA2用同样的方法检测,结果表明两个干扰质粒均有干扰效果,但N-Cad-shRNA1干扰效果更优。4.通过小鼠子宫内电转基因方法成功实现了N-Cadherin在小鼠大脑皮层的抑制表达和超表达,发现抑制N-Cadherin的表达导致大脑皮层神经细胞停滞在VZ区及SVZ区,不能正常迁移；而N-Cadherin的超表达对大脑皮层神经细胞的迁移未见明显影响。5.将小鼠脂肪间充质干细胞体外诱导成类神经细胞后,观察到GFAP表达呈阳性,RT-PCR结果显示N-Cadherin表达显著升高,β-catenin、ADAM9和ADAM17表达显著降低。结论1.成功建立了以GFP作为报告基因的小鼠子宫内电转基因方法。2.筛选出一个在小鼠子宫内电转中适合作报告基因的质粒pCAGGS-GFP,并确定其最佳浓度。3.筛选出一个能够有效干扰小鼠N-Cadherin表达的干扰序列,并获得了相应的干扰质粒。4.在小鼠大脑皮层发育过程中,超表达N-Cadherin后未见对室管膜细胞迁移有明显影响,而干扰N-Cadherin的表达后则明显抑制其向外迁移,暗示N-Cadherin对室管膜神经细胞向外迁移具有重要作用。5.体外诱导小鼠脂肪间充质干细胞成为类神经细胞后,发现N-Cadherin基因表达显著升高,而β-catenin、ADAM9和ADAM17则显著降低,暗示N-Cadherin可能与β-catenin、ADAM9和DAM17有着密切关系,并且在干细胞向神经细胞分化过程中起着重要作用。