目的：1.使用血清学的方法,调查我院引起儿章腹泻的致病菌中,EPEC所占的比率,并使用PCR方法确定.EPEC中所携带的毒力基因(eae,EAF,bfpA)情况. 2.根据EPEC所携带的毒力基因的不同,观察与临床腹泻的相关性. 3.建立一种使用荧光染料SYBR GREEN I直接对粪便标本中EPEC毒力基因eae进行荧光定量的方法,以确定在一定量的粪便标本中 eae 基因的量与腹泻程度是否存在相关性. 4.比较并评价检测EPEC的血清学方法和SYBR GREEN I荧光定量PCR直接从粪便标本中检测毒力基因的方法,寻求适合临床微生物实验室应用的检测方法. 5.分析本地区引起儿章腹泻的.EPEC的耐药情况和临床分布特点,以便了解其感染状况,指导临床合理用药. 6.分析EPEC中,整合子的整合酶及插入的相关基因盒情况. 方法： 1.收集温州医学院附属第:二医院&育英儿章医院2006年4月～2006年9月间微生物室收到的儿章的粪便标本,无菌操作接种于麦康凯培养基上,挑选4个发酵乳糖、2个不发酵乳糖的菌落接种于KIA和半固体上,35℃孵浴18小时后,疑似为大肠埃希菌的使用.EPEC诊断血清进行凝集.EPEC的确证试验使用PCR法扩增相关的毒力基因. 2.将上述患者分为腹泻组和非腹泻组,首先观察EPEC的分离情况,然后使用PCR法扩增EPEC相关的毒力基因,观察EPEC所携带的毒力基因在不同组之间的情况. 3.药敏试验采用K-B琼脂扩散法,对20种药物的试验结果按2006版NCCLS标准进行判断.ESBL的判断用头孢他啶(30μg)及头孢他啶/克拉维酸(30μg/10μg)组合、头孢噻肟(30μg)及头孢噻肟/克拉维酸(30μg/10μg)组合,各纸片相距至少24mm贴于M-H平板上,在35℃孵浴24小时后测量抑菌环,任一组药物的抑菌环的直径差≥5mm时判断ESBL为阳性. 4.将一定量的粪便标本用生理盐水洗涤二次后,制备成1.5ml 0.5麦氏浊度的悬液,收集菌体后,以经典提取DNA的方法<[1]>为基础,经过适当的改良后,提取细菌的总DNA.使用SYBR GREEN Ⅰ实时荧光定量PCR的方法,对细菌总DNA中EPEC的毒力基因eae进行定量测定. 5.SYBR GREEN Ⅰ实时定量FCR反应在ABI 7500型PCR扩增仪上进行,所用试剂盒为Takara公司的Takara Taq试剂盒, SYBR GREEN Ⅰ原液为Roche公司产品.首先对反应体系中所加入稀释的SYBR GREEN Ⅰ的量进行优化,然后对Mg<2+>浓度、引物浓度进行优化. 6.对使用SYBR GREEN Ⅰ荧光定量方法检测出eae基因的患者的病例进行查找,观察eae基因的量与腹泻严重程度的关系. 7.对确证为EPEC的细菌DNA进行提取,使用PCR方法对整合子的整合酶基因及在整合子中插入的基因盒进行扩增. 结果： 1.在2006年4月～2006年9月间微生物室共收到不重复鉴定的儿章粪便标本总计504例,其中465例来自我院住院患儿的标本,39例为门诊患儿的标本,使用血清学方法分离到致病性大肠埃希菌34株,以上这些菌株均来自1月～7岁的儿章.经PCR扩增EPEC相关毒力基因(eae、EAF和bfpA)进行确证试验,以上血清学分离到的细菌均为EPEC. 2.这34株EPEC中,归属于10种血清型,其中以O<,55>:K<,59>、O<,86>:K<,61>和O<,44>:K<,74>血清型最为多见,合计19例,占55.89﹪(19/34). 3.在上述患者中,原始诊断为腹泻病的有390例,非腹泻病的为114例,其中从腹泻病患者中检出EPEC 31株,阳性率为7.94﹪(31/390):非腹泻组114例,检出EPEC 3例,阳性率为2.63﹪(3/114),有显著差异,P<0.05,而且从腹泻患者粪便中分离到的EPEC大多携带三种毒力基因. 4.在34株EPEC中,ESBL为14株.分离株对青霉素类、第一代、二代、三代和四代头孢菌素的耐药率为44.12﹪～73.53﹪,对头孢西丁、喹诺酮类的耐药率分别为5.88﹪和14.70﹪,而对氨基糖苷类的耐药率为5.88﹪～29.41﹪. 5.在34株EPEC中,共有18株细菌扩增出整合子Ⅰ整合酶片段,在14株ESBL阳性细菌中扩增出11株,有7株ESBI.阴性细菌扩增出相应的片段.在这所有的34株细菌中未检出整合子Ⅱ和Ⅲ. 6.在18株携带整合酶基因的EPEC中,共有14株细菌含有插入的整合子Ⅰ相关基因盒,片段长度在150～3000bp之间.整合酶阳性和阴性的EPEC对复方新诺明和妥布霉素的耐药性有显著差异. 7.对本院细菌室2006年6月～2006年8月间收到的不重复鉴定的252例小儿粪便标本,提取总DNA,使用SYBR GREEN Ⅰ荧光定量方法检测出EPEC eae基因23例,而此时血清学方法共检测到16例EPEC. 结论： 1.了解了EPEC的血清型分布情况,为流行病学的分析提供了准确可靠的资料. 2.了解了EPEC毒力基因与腹泻的关系,为进一步研究EPEC所引起腹泻的分子机制奠定了基础. 3.EPEC是引起婴幼儿腹泻的重要致病菌之一,本试验成功的建立了使用SYBR GREEN Ⅰ荧光定量PCR方法,直接从粪便标本中检测其毒力基因eae. 4.SYBR GREEN Ⅰ荧光定量PCR检测EPEC毒力基因eae的方法,与血清学方法比较既能提高了阳性检出率又能根据eae基因的量提示腹泻的严重程度. 5.合理的用药对于治疗EPEC引起的腹泻并控制其在患者间的爆发流行具有重要意义. 6.整合子是导致细菌多重耐药的一个重要因素,合理用药,控制耐药基因的传播是当前医学面临的一个重要问题.