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肌球蛋白约占鱼肌原纤维蛋白质的50%以上,它主要决定了鱼肌肉蛋白质的功能和性质,进而影响鱼肌肉蛋白质的加工适性。肌球蛋白分子由两条重链亚基和四条轻链亚基组成。肌球蛋白重链的球状头部具有ATPase活性和与肌动蛋白结合的能力;纤维状的杆状部分在生理性离子强度下具有形成丝状的能力,并与鱼肌肉蛋白质的凝胶形成能力有关。本文选取广温性四大家鱼中的草鱼(Ctenopharyngodon idellus)和鲢鱼(Hypophthalmichthys molitrix)作为研究对象,第一部分的研究工作主要考察了热驯化条件下,草鱼骨骼肌肌球蛋白热稳定性和动态粘弹性的变化规律。第二部分的研究工作,通过RT-PCR法考察了已知的三种草鱼肌球蛋白重链同工型基因在不同热驯化阶段草鱼骨骼肌中的表达模式,旨在阐明草鱼肌肉蛋白质功能性质伴随环境温度发生变化的分子机理。第三部分的研究工作主要通过RT-PCR法和3-RACE法从冬季和夏季鲢鱼的骨骼肌中分离到两种肌球蛋白重链同工型基因,并通过Long-PCR法对它们的轻酶解肌球蛋白的部分编码序列进行了cDNA克隆及氨基酸序列的推断和解析。
一.基于热驯化的草鱼骨骼肌肌球蛋白热稳定性和动态粘弹性的变化
对在30℃热驯化条件下驯化不同时间的草鱼骨骼肌肌球蛋白进行提取和纯化,通过SDS-PAGE电泳证实提取的肌球蛋白具有较高的纯度。对在30℃热驯化温度下驯化不同时间的草鱼肌球蛋白在40℃的热变性温度下的变性速率常数KD进行了测定,证明肌球蛋白的热变性符合一级变性速率方程;研究结果显示,草鱼肌球蛋白的热稳定性明显随驯化时间的延长而升高,热驯化77天的草鱼肌球蛋白的热稳定性为未经驯化草鱼热稳定性的近33倍。
通过差示扫描量热仪(DSC)对未驯化和30℃驯化31天的草鱼的热稳定性进行了测定和比较,研究结果表明,草鱼肌球蛋白的热稳定性受热驯化时间变化的影响,未驯化和30℃热驯化31天的草鱼肌球蛋白的热转化温度(Tm)分别为37和43.6℃,表明两者肌球蛋白的结构可能不同,进而证明了30℃热驯化草鱼肌球蛋白的热稳定性优于未经热驯化的草鱼肌球蛋白。
此外,通过测定不同热驯化阶段草鱼肌球蛋白动态黏弹性的变化,在流变学理论上证明淡水鱼肌球蛋白的凝胶特性与热驯化之间的关系。研究结果表明,草鱼肌球蛋白的凝胶形成特性受热驯化时间长短的影响;未经热驯化的草鱼肌球蛋白形成凝胶的温度低于热驯化49、63、77天的草鱼,表明肌球蛋白的热稳定性越差,其形成凝胶的起始温度亦越低。
二.三种草鱼肌球蛋白重链同工型基因在不同热驯化阶段草鱼骨骼肌中的表达模式
通过RT-PCR法考察了草鱼三种肌球蛋白重链同工型基因在不同热驯化阶段草鱼骨骼肌中的表达模式,结果表明:热驯化0-31天的草鱼肌肉中主要表达低温型(gc-10)的肌球蛋白重链同工型基因,而中间型(gcI)和高温型(gc-30)的肌球蛋白重链同工型基因在热驯化19-77天的草鱼肌肉中都有表达,且高温型(gc-30)表达量相对要多。据此,可以认为热驯化不同时间的草鱼在肌球蛋白的性质和功能上展现的差异可能与肌球蛋白重链同工型基因的差异表达有关。
三.鲢鱼部分轻酶解肌球蛋白同工型基因的cDNA克隆
通过RT-PCR法和3-RACE法从冬季和夏季鲢鱼的骨骼肌中分离到两种肌球蛋白重链同工型基因,分别命名为低温型(SC-W)和高温型(SC-S)。两种同工型基因的cDNA序列包含了部分3-翻译区和全部3-非翻译区,编码了鲢鱼轻酶解肌球蛋白(light meromyosin,LMM)羧基端的一部分氨基酸序列。在终止密码子的上游和下游区域,两种同工型基因之间在核苷酸序列上显示了明显的差异,其序列同源性为79.5%,推断的氨基酸序列的同源性为88.1%;根据与草鱼和鲤鱼相关同工型氨基酸序列的比对结果,发现在15个氨基酸残基位点上鲢鱼低温型(sc-w)与草鱼10℃型(gc10)一致,但两者显示了与其它同工型不同的特有变异,并且其中的11个位点属高度保守性残基。这些结果似乎表明了基于低温驯化的淡水鱼表达的肌球蛋白重链同工型必须在它们的初级结构上发生某些氨基酸残基的变异才能有助于其适应低温的栖息环境,在蛋白质水平上则展现出完全不同于高温栖息鱼类的肌球蛋白功能和性质。另一方面,通过构建分子系统树,证明了来自相似栖息环境温度的鱼的肌球蛋白重链之间具有更近的基因距离,进一步证明了环境温度对广温性淡水鱼肌球蛋白重链的基因歧化和功能进化的影响。