蚯蚓纤溶酶组分抗原性、体内代谢及原位定位的分析

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蚯蚓纤溶酶是从不同种属的蚯蚓中均可分离到的一种多组分的纤维蛋白水解酶,具有直接纤溶活性和纤溶酶原激活活性,既能溶解陈旧血栓又能抑制新血栓形成,实验表明该酶具有抗凝、溶纤、改善血液流变学性质,可以口服,而且稳定性好、纤溶活性强、药理作用广泛、副作用小,目前已广泛用于临床,是预防和治疗血栓疾病的有效药物。本文就蚯蚓纤溶酶组分的抗原性、体内代谢及其在赤子爱胜蚓体内的原位定位进行了研究,为其生物化学、细胞生物学以及临床应用方面的深入研究提供参考资料。主要从以下几个方面进行了研究:1.以热变性蚯蚓纤溶酶组分EfP-0-2、EfP-Ⅰ-1、EfP-Ⅱ-1,以及重组蛋白EfP-Ⅲ-2为抗原免疫家兔获得了抗血清,利用获得的抗血清对部分组分的免疫学同一性进行了验证。EfP-0、EfP-Ⅰ、EfP-Ⅱ的免疫双扩散反应表明EfP-Ⅰ和EfP-Ⅱ具有部分免疫学同一性。利用DNAMAN软件对获得的EfP-0、EfP-Ⅰ、EfP-Ⅱ、EfP-Ⅳ的蛋白质序列进行了初步分析,包括整个序列相似性比对、氨基酸组成、蛋白酶消化、抗原肽、疏水性和亲水性轮廓等,并对N端氨基酸序列进行了分析,结果表明EfP-Ⅰ和EfP-Ⅱ具有部分免疫学同一性是由它们蛋白质序列的组成和结构决定的。2.利用获得的蚯蚓纤溶酶组分的特异性抗体作探针和高度灵敏的ELISA来研究蚯蚓纤溶酶组分在消化道内的吸收率和半衰期。由于蚯蚓纤溶酶的最适PH值近中性,而胃液的酸性较强,所以小鼠口服水溶性蚯蚓纤溶酶组分EfP-0-2、EfP-Ⅰ-1、EfP-Ⅱ-1和EFE,在胃液中会有一定的损失,血清中含量极低,只有180min检测到有少量蚯蚓纤溶酶存在。与口服相比静脉注射在生物体内的利用率相对较高,小鼠静脉注射蚯蚓纤溶酶组分EfP-0-2、EfP-Ⅰ-1、EfP-Ⅱ-1和EFE,随着时间的延长,它们在体内的含量逐渐下降,但是单一组分比混合组分在体内具有更长的半衰期,如果能将蚯蚓纤溶酶单一组分的纯品制成静脉注射用的针剂,那么就可以用来治疗一些急性血栓病。3.利用光镜免疫组织化学技术,结合制备和保存的多克隆抗血清,对蚯蚓纤溶酶组分在赤子爱胜蚓体内的原位定位,进行了初步的探索。结果发现,蚯蚓纤溶酶组分定位和表达在围绕生殖环的消化道上皮细胞,除了口部和后肠之外,位于前部的消化区域具有较高的酶活性。这个区域包括嗉囊、砂囊、胃和前部的肠,是重要的储存和消化食物的器官。EfP-0主要分布在嗉囊、砂囊和前部的肠;EfP-Ⅰ是蚯蚓体内含量最多的组分,主要分布在嗉囊、砂囊、胃和前部的肠;EfP-Ⅱ主要分布在嗉囊和砂囊;EfP-Ⅲ主要分布在嗉囊、砂囊和胃肠连接处。由于EfP-Ⅱ具有广泛的底物特异性,所以它主要位于消化道的前部,对食物进行初步消化。EfP-Ⅲ的高活性和高稳定性负责对从胃进入小肠的食物进行彻底的分解,以便小肠吸收。EfP-0和EfP-Ⅰ协助EfP-Ⅱ和EfP-Ⅲ完成整个消化过程。
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