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目的:应用较为适宜神经干细胞(neural stem cells,NSCs)增殖的实验条件,通过对不同发育阶段大鼠海马神经干细胞的体外培养的形态学观察及免疫组织化学结果分析,探讨海马源性神经干细胞增殖、分化特性在不同发育阶段是否存在差异及其可能的影响因素;为NSCs的深入研究与临床应用打基础.方法:1、原代细胞培养取材于胎龄18天(embryonic day 18,ED18)、出生24h以内(postnatal within 24h,P0)、一月龄(1 month,M1)及2月龄(2month,M2)的大鼠海马组织.①采用机械吹打法分离海马组织形成神经细胞悬液,台盼蓝染色鉴定活细胞比例,然后均以1×10<6>个细胞/ml密度接种到含有20ng/ml EGF、20ng/ml bFGF及B27+DMEM/F12基础培养基的25ml培养瓶中,置37℃、5﹪CO<,2>平衡湿度培养箱进行原代培养,在倒置显微镜下观察细胞生长及分化的形态学变化.②将原代培养形成的神经球(neurosphere)机械分离成单细胞悬液,按1:2的比例,以上述方法进行传代培养并观察.③将原代或传代细胞球机械分离成单细胞悬液,用有限稀释法进行单克隆培养.④为进行分化研究,将细胞球种在铺有多聚鸟氨酸的培养板中,培养液为含有1﹪FBS的基础培养液;2、免疫细胞化学鉴定:12h和4d后用神经巢蛋白(Nestin)多克隆抗体行免疫细胞化学及免疫荧光鉴定NSCs,2d、5d、7d、14d、21d后用β-Ⅲ Tubulin、GFAP单克隆抗体和GalC多克隆抗体行免疫细胞化学染色,计数分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的比例.结果:1、在相同培养条件下,原代培养6h时,各组细胞数量及形态无明显区别.2、传代细胞能形成与原代相似的细胞球,并可继续传代培养.3、免疫细胞化学显示:诱导分化12h时各组的细胞球中绝大部分细胞为Nestin<+>,分化4d时仍有少数细胞为Nestin<+>.4、ED18和P0段大鼠海马NSCs与M1和M2段大鼠海马NSCs在增殖、分化特性上存在着明显差异.结论:不同发育阶段的大鼠海马内均存在着NSCs,它们可以体外扩增、传代,诱导分化后可表达神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞标记物.且其增殖分化特性在不同发育阶段存在一定的差异.随着发育阶段的增长,能够形成神经球的细胞数量减少,且在增殖产生的神经细胞中有神经元分化减少趋势.