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急性呼吸窘迫综合征(Acute Respiratory Distress Syndrome,ARDS)是一种以急性呼吸衰竭及严重低氧血症为特征的危重疾病。尽管临床医疗措施不断进步,但是这一危重疾病的死亡率仍>30%,是重症监护病房内威胁患者生命的主要原因之一。急性呼吸窘迫综合征可由各种肺内、肺外致病因素导致,其中脓毒症是最常见的病因。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),由革兰氏阴性菌细胞壁释放而出,被认为是导致严重脓毒症的始发因素。近年来的研究显示,肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system,RAS)包含两个功能互相拮抗的轴系:血管紧张素转换酶(ACE)-血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)-血管紧张素Ⅱ的1型受体(AT-1R)和血管紧张素2(ACE2)-血管紧张素1-7(Ang1-7)-Mas受体。其中,ACE和ACE2协同调节AngⅡ及Ang1-7的水平,可能在ARDS的发生发展中起重要作用;然而,其在局部肺组织的调节和具体的信号传导机制尚未阐明。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)信号通路是细胞信号转导系统的重要组成部分,在急性肺损伤(acute lung injury,ALI)过程中发挥关键作用。因此,我们提出假设:在LPS导致急性肺损伤过程中,局部RAS成分发生改变,调控局部ACE/ACE2的表达可改善肺损伤,而MAPKs信号通路在其中发挥关键信号转导作用。本研究共分以下三部分内容:第一部分血管紧张素抑制剂(ACEI)预处理对LPS诱导大鼠急性肺损伤的作用及其机制目的:观察ACEI预处理在LPS导致急性肺损伤时的作用并探讨其作用机制。方法:体内实验-经尾静脉注射LPS(7.5mg/Kg)建立大鼠急性肺损伤模型;干预组大鼠在注射LPS前30分钟经腹腔给予卡托普利(Captopril,50mg/Kg)预处理,对照组给予等量生理盐水。体外实验-大鼠肺微血管内皮细胞经卡托普利(10-5mol/ml),或合并应用ACE2抑制剂MLN-4760(10-7mol/ml)预处理30分钟后给予LPS(1mg/ml)刺激。肺组织切片HE染色评估肺损伤程度,免疫组化染色及western-blot检测肺组织ACE/ACE2表达,ELISA法检测血浆及细胞培养液中细胞因子TNF-α、IL-6、AngⅡ及Ang1-7浓度,western-blot法检测细胞中ACE/ACE2表达及MAPKs信号通路激活。结果:卡托普利预处理可明显减轻LPS导致的肺组织病理改变,抑制炎症因子TNF-α及IL-6分泌,降低血浆AngⅡ/Ang1-7比例,并逆转肺组织中ACE上调和ACE2下调的表达变化,显著降低ACE/ACE2比值(LPS组为7.07,LPS+Captopril组为1.71)。卡托普利的保护作用在体外实验中亦得到证实。卡托普利预处理明显减轻LPS所致细胞毒性,抑制细胞因子产生,也显著降低ACE/ACE2表达比值(LPS组为5.18,LPS+Captopril组为1.52)。另外,卡托普利预处理可明显抑制LPS刺激所致细胞p38MAPK、ERK1/2及JNK磷酸化水平升高。同时应用MLN-4760预处理可阻断卡托普利对LPS所致细胞毒性的保护作用及对LPS导致p38MAPK、ERK1/2及JNK磷酸化的抑制作用。结论:ACEI预处理可能通过调节局部ACE/ACE2表达平衡及抑制MAPKs信号通路活化,发挥对LPS所致急性肺损伤及PMVECs细胞毒性的保护作用。第二部分慢病毒转染Ace2或sh RNA-Ace2调控大鼠PMVECs的ACE2表达对LPS诱导细胞凋亡和炎症反应的作用及其机制目的:通过调控ACE2在肺微血管内皮细胞中的表达,探讨其对LPS诱导细胞凋亡和炎症反应的作用及信号机制。方法:应用慢病毒转染Ace2或sh RNA-Ace2,使ACE2在PMVECs过表达或抑制,结合应用Mas受体阻滞剂A779(100 n M)、MAPKs通路阻滞剂(SB20358010μM,PD98059 20μM,SP600125 20μM)预处理后,给予LPS(1mg/ml)刺激。流式细胞仪检测细胞凋亡率,ELISA法检测细胞培养液中细胞因子TNF-α、IL-1β、AngⅡ及Ang1-7浓度,western-blot法检测细胞中ACE/ACE2表达及MAPKs/NF-κB信号通路激活。结果:LPS刺激导致PMVECs分泌炎症因子及AngⅡ及Ang1-7明显增加,细胞凋亡显著,并伴有ACE2/ACE比值明显下降;过表达ACE2可明显减少LPS导致的细胞凋亡和炎症因子释放,并使ACE2/ACE比值及Ang1-7水平显著升高;而抑制ACE2表达则进一步加重细胞凋亡和炎症反应;应用A779预处理可完全消除ACE2对细胞的这种保护作用。LPS刺激可使细胞内p38、ERK1/2、JNK及NF-κB信号通路激活,A799预处理进一步提高其磷酸化水平。A779预处理亦可阻断过表达ACE2对p38、JNK磷酸化及NF-κB激活的抑制。然而,仅有JNK阻断剂可明显减轻由下调ACE2或A779预处理恶化的LPS所致细胞凋亡及炎症反应。结论:ACE2/Ang1-7/Mas受体轴在抑制LPS诱导PMVECs凋亡及炎症反应中发挥重要作用,其机制可能是通过阻滞JNK/NF-κB信号通路激活。第三部分慢病毒转染Ace2或sh RNA-Ace2调控大鼠肺内ACE2表达对LPS诱导急性肺损伤的作用及其机制目的:通过调控大鼠肺内ACE2表达,观察其对LPS诱导急性肺损伤的作用及信号机制。方法:经气管内滴注慢病毒颗粒包裹的Ace2或shRNA-Ace2进行大鼠肺内转染调节ACE2的表达,或结合应用MLN-4760(1mg/Kg)或A779(10μg/kg)预处理,继之经尾静脉注射LPS(7.5mg/Kg)建立肺损伤模型。肺组织切片HE染色评估肺损伤程度,ELISA法检测肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β、AngⅡ及Ang1-7浓度,western-blot法检测肺组织中ACE/ACE2表达及MAPKs信号通路磷酸化水平,RT-PCR法检测肺组织中Mas m RNA表达。结果:ACE2过表达可以明显减轻LPS诱导的急性肺损伤程度及炎症因子释放,抑制ACE2表达则显著恶化肺损伤及炎症反应,而药物阻断Mas受体或ACE2均可抑制过表达ACE2的这一保护作用。过表达ACE2可明显降低肺泡灌洗液中AngⅡ/Ang1-7比例,并上调Mas m RNA表达,而Mas受体阻断剂或ACE2抑制剂均可显著逆转上述变化。ACE2过表达可明显抑制LPS导致p38、ERK1/2、及JNK激活,而抑制ACE2表达则明显增强ERK1/2、JNK磷酸化水平。Mas受体阻断剂或ACE2抑制剂均可明显消除ACE2过表达对p38、ERK1/2磷酸化的抑制。结论:ACE2主要通过Ang1-7/Mas途径及抑制p38、EKR1/2信号通路激活发挥对LPS诱导急性肺损伤的保护作用。总结在内毒素导致急性肺损伤过程中,肺组织内ACE2及ACE表达失衡及其导致的AngⅡ/Ang1-7比值变化具有重要作用;上调ACE2表达可在肺损伤过程中发挥保护作用,其作用机制主要是通过Ang1-7/Mas受体途径,并抑制MAPKs/NF-κB信号通路激活。