研究背景非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)是除外酒精及其他明确肝损害因素所致的肝细胞内甘油三酯蓄积为主要特征的临床综合症。NAFLD的疾病谱包括单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(Non-alcoholic steatohepatitis, NASH)、非酒精性脂肪性纤维化和非酒精性脂肪性肝硬化四种主要类型。NAFLD通常合并肥胖和(或)2型糖尿病、高脂血症及其相关的心脑血管疾病,也与肝硬化、原发性肝癌和肝功能衰竭的发病有着密切关联。随着社会的经济发展,NAFLD已成为我国继病毒性肝炎之后第二大慢性肝病,严重危害我国人民的生命健康。在NAFLD研究中困扰我们的主要问题是：1.发病机制问题：NAFLD的发病机制错综复杂,目前仍未完全阐明。迄今为止,最成熟的假说是Day等提出的的“二次打击”学说。初次打击是指由胰岛素抵抗等因素引起的肝内甘油三酯和游离脂肪酸蓄积；脂肪化的肝细胞对内、外源性有害因子刺激更为敏感,出现氧化应激、脂质过氧化、细胞因子的释放和Fas配体的诱导活化,引起肝细胞炎症、坏死,即为第二次打击。“二次打击”学说虽提出了基本的概念,但并不足以揭示NAFLD发生发展的全貌；2.药物治疗问题：NAFLD的治疗提倡改变生活方式、去除病因诱因等基础治疗,必要时予以保肝、抗炎、抗纤维化类药物辅助治疗。然而,目前临床上仍缺少有效的特效药物,对于NAFLD的新药开发具有重要的现实意义。建立一种经济实用而又简单易行的动物模型对NAFLD发病机制和防治药物开发具有深远意义。与啮齿动物相比,斑马鱼的生理优势体现在：1.体积小,繁殖能力强,易于大规模饲养；2.发育迅速、性成熟期短,实验周期相对较短；3.胚胎透明,器官清晰可见,易于活体观察病变；4.基因组序列的注释已全部完成；5.在药物筛选方面,易于获得足够的样本量,便于大规模筛选。然而,迄今为止国内对于NAFLD的基础研究还是以啮齿动物为主,尚未有斑马鱼NAFLD模型的相关报道。本研究旨在利用斑马鱼独特的生理结构优势,采用单纯高脂或联合高胆固醇饲料喂食的方式在国内外首次建立一种简单易行而又经济实用的斑马鱼幼鱼NAFLD模型。在模型建立成功的前提下,采用依替米贝、辛伐他汀两种药物进行干预,利用现代分子生物学手段系统评估药物的疗效并验证模型的稳定性。最后,从脂质代谢、内质网应激、炎症方面探讨NAFLD的发病机制和药物的作用机制,以期为NAFLD的相关机制研究和药物开发提供新的思路。研究目的1.采用高脂饲料和高脂联合高胆固醇饲料喂食的方式建立一种简单易行、重复性好的斑马鱼幼鱼非酒精性脂肪肝模型。2.观察依替米贝、辛伐他汀两种药物对非酒精性脂肪肝斑马鱼幼鱼的影响,包括一般情况(生存率、进食和游动情况),体长和体重测定,生化学指标,肝内脂质沉积情况及肝脏病理等关键指标,综合评估依替米贝、辛伐他汀对非酒精性脂肪肝是否具有保护作用。3.研究非酒精性脂肪肝发病机制和依替米贝、辛伐他汀两种药物作用机制,包括对脂质代谢、内质网应激、炎症通路相关基因和蛋白表达水平的影响。研究方法1.实验动物野生型AB品系斑马鱼由南方医科大学人类疾病斑马鱼模型和药物筛选重点实验室提供,按照Westerfield方法对斑马鱼进行养殖。在模型建立时,将发育正常的幼鱼完全随机分为四组,分别为：正常对照组,高脂组,2.5%高脂高胆固醇组,5.0%高脂高胆固醇组。在药效观察时,实验为四组,分别为：正常对照组,2.5%高脂高胆固醇组(模型组),依替米贝干预组和辛伐他汀干预组。参照文献中药物的浓度和给药方式,依替米贝以1μM浓度直接添加到养鱼水中,辛伐他汀以50μg/g的浓度添加到饲料中。2.斑马鱼幼鱼一般情况观察每日观察斑马鱼幼鱼生长、进食、活动度和死亡情况。于处理时间点记录斑马鱼体长并测量体重。3.斑马鱼幼鱼整体油红染色收集各组斑马鱼幼鱼于6孔板中,4%多聚甲醛4℃固定过夜,PBS洗涤2次,依次浸入80%、100%丙二醇,每个浓度20分钟,然后加入新鲜配制的0.5%油红室温孵育过夜,注意避光。次日,将染液吸出,PBS洗涤2次,然后100%、80%丙二醇从高浓度到低浓度洗净背景,每个浓度30分钟。将染色完成的样本置于80%丙二醇中,4℃冰箱保存。Olympus szx10体式显微镜下观察肝细胞脂质沉积情况并进行拍照,记录脂肪肝发生率。4.斑马鱼幼鱼冰冻切片和油红染色收集各组斑马鱼幼鱼于1.5m1 EP管中,4%多聚甲醛4℃固定过夜。次日,加入30%蔗糖脱水,4℃脱水过夜。将脱水完全的幼鱼用OCT包埋剂包埋,10μm切片,行油红染色,Olympus BX51光镜下观察肝脏脂质沉积情况并拍照记录。5.斑马鱼幼鱼组织病理学切片和苏木素-伊红染色收集各组斑马鱼幼鱼于1.5ml EP管中,4%多聚甲醛4℃固定过夜。次日,酒精按低浓度到高浓度进行脱水,二甲苯进行透明处理,浸蜡后将组织进行包埋,4μm切片,行苏木素-伊红染液染色,Olympus BX51光镜下观察肝脏病理变化并拍照记录。6.斑马鱼幼鱼肝组织生化指标检测显微镜下剥离每组斑马鱼幼鱼肝脏,每组约50-70条。裂解液将组织充分裂解,离心,取上清待测。按照试剂说明书进行操作,检测幼鱼肝组织内甘油三酯(Triglyceride, TG)、总胆固醇(Total cholesterol, TC)和游离胆固醇(Free cholesterol, FC)的含量。7. Real-time RT-PCR显微镜下剥离每组斑马鱼幼鱼肝脏置于1.5ml去RNA酶的EP管中,每组约为20-30条。迅速加入Trizol,总RNA按照步骤提取。RNA的纯度和浓度通过紫外分光光度法(Nanodrop, Thermo Fisher Scientific, USA)测定。利用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒反转录成cDNA.实时定量聚合酶连锁反应采用Light Cycler 480 (Roche, Basel, Switzerland)进行检测。8. Western-blotting显微镜下剥离每组斑马鱼幼鱼肝脏置于1.5ml EP管中,每组约20-30条。迅速加入RIPA裂解液,按照步骤提取总蛋白。蛋白浓度通过BCA法测定,酶标仪测定各样本OD值,根据标准曲线计算样本蛋白浓度。将聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离的蛋白样品转移到PVDF膜上,室温封闭1小时后,一抗4℃孵育过夜。次日,洗涤一抗后孵育二抗,暗室发光,观察目的蛋白条带。9.统计学分析应用SPSS16.0统计软件进行统计学分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示,组间两两比较采用one-way ANOVA。作图用Graphpad Prism 5 (Graphpad, La Jolla,CA,USA)软件。P<0.05有显著统计学差异。研究结果第一章非酒精性脂肪肝斑马鱼幼鱼模型的建立1.高脂高胆固醇喂食对斑马鱼幼鱼生存率的影响喂养到第10天时,对照组、高脂组、2.5%高脂高胆固醇组和5.0%高脂高胆固醇组斑马鱼幼鱼生存率分别为96.67±5.79%,88.66±8.59%,90.00±5.93%,94.67±5.89%,各组之间均无统计学差异(P>0.05)。2.高脂高胆固醇喂食对斑马鱼幼鱼体长的影响喂养到第7和第10天时,高脂组和两个不同浓度高脂高胆固醇组斑马鱼幼鱼体长显著长于对照组(P<0.01,n=90),而体长在2.5%高脂高胆固醇组和5.0%高脂高胆固醇组之间无显著差异(P>0.05,n=90)。3.高脂高胆固醇喂食对斑马鱼幼鱼体重的影响喂养到第7天和第10天时,高脂组和两个不同浓度高脂高胆固醇组斑马鱼幼鱼较对照组体重显著增加(P<0.01,n=90),而体重在2.5%高脂高胆固醇组和5.0%高脂高胆固醇组之间无显著差异(P>0.05,n=90)。4.高脂高胆固醇喂食导致斑马鱼幼鱼肝内大量脂滴沉积整体油红染色和冰冻切片油红染色结果显示：与对照组相比,高脂组斑马鱼幼鱼肝内染色加深。与高脂组相比,高脂高胆固醇组肝内染色更为显著。5.高脂高胆固醇喂食对斑马鱼幼鱼脂肪肝发生率的影响喂食到第7天和第10天时,与对照组相比,高脂组和高脂高胆固醇组斑马鱼幼鱼脂肪肝发生率显著增高(P<0.001,n>100)。6.高脂高胆固醇喂食对斑马鱼幼鱼肝组织生化指标的影响与对照组相比,高脂组和两个不同浓度高脂高胆固醇组斑马鱼幼鱼肝内TG、TC、FC水平明显增高,组间存在显著差异(P<0.05)。与高脂组相比,两个不同浓度高脂高胆固醇组肝内TC、FC水平升高的更为显著(P<0.001)。7.高脂高胆固醇喂食对斑马鱼幼鱼肝脏组织病理的影响光镜下对照组斑马鱼幼鱼肝组织形态学正常,高脂组和高脂高胆固醇组肝细胞结构异常,脂滴将核挤至一边,肝内可见脂滴。第二章依替米贝、辛伐他汀对非酒精性脂肪肝斑马鱼幼鱼的疗效性研究1.依替米贝、辛伐他汀对NAFLD幼鱼生存率的影响喂养到第10天时,对照组、2.5%高脂高胆固醇组、依替米贝干预组和辛伐他汀干预组斑马鱼生存率分别为85.00±5.22%,80.00±4.20%,82.67±5.47%,81.17±5.12%,各组之间均无统计学差异(P>0.05)。2.依替米贝、辛伐他汀对NAFLD幼鱼体长的影响喂养到第7天和第10天时,与对照组相比,2.5%高脂高胆固醇组幼鱼的体长显著增长(P=0.000,n=90)。喂养到第7天和第10天时,与2.5%高脂高胆固醇组相比,依替米贝干预组和辛伐他汀干预组幼鱼体长显著下降(P<0.01,n=90)。3.依替米贝、辛伐他汀对NAFLD幼鱼体重的影响喂养到第7天和第10天时,与对照组相比,2.5%高脂高胆固醇组幼鱼的体重显著增长(P=0.000,n=90)。喂养到第7天时,与2.5%高脂高胆固醇组相比,依替米贝干预组和辛伐他汀干预组幼鱼体长显著下降(依替米贝干预组对比2.5%高脂高胆固醇组,P=0.011；辛伐他汀干预组对比2.5%高脂高胆固醇组,P=0.001)；喂养到第10天时,与2.5%高脂高胆固醇组相比,依替米贝干预组和辛伐他汀干预组幼鱼体长有所下降,但无统计学意义(依替米贝干预组对比2.5%高脂高胆固醇组,P=0.291；辛伐他汀干预组对比2.5%高脂高胆固醇组,P=0.127)。4.依替米贝、辛伐他汀对NAFLD幼鱼肝内脂质沉积情况的影响整体油红染色和冰冻切片油红染色的结果显示：与对照组相比,2.5%高脂高胆固醇组幼鱼肝脏染色加深,肝内脂质沉积增多；与2.5%高脂高胆固醇组相比,依替米贝干预组和辛伐他汀干预组幼鱼肝脏染色明显减轻,肝脏脂质沉积减少；与辛伐他汀干预组相比,依替米贝干预组改善幼鱼脂肪肝的效果更为显著。5.依替米贝、辛伐他汀对NAFLD幼鱼肝组织生化指标的影响与对照组相比,2.5%高脂高胆固醇组幼鱼肝内TG、TC、FC水平显著增高(P<0.001)。与2.5%高脂高胆固醇组相比,依替米贝干预组和辛伐他汀干预组幼鱼TG、TC、FC水平均有所下降(依替米贝干预组对比2.5%高脂高胆固醇组,P<0.01；辛伐他汀干预组对比2.5%高脂高胆固醇组,P<0.05)。与辛伐他汀干预组相比,依替米贝干预组TC、FC水平下降的更为显著(P<0.001)。6.依替米贝、辛伐他汀对NAFLD幼鱼肝脏组织病理的影响光镜下对照组幼鱼肝细胞结构正常,无脂质空泡；2.5%高脂高胆固醇组幼鱼肝组织形态学结构异常,可见弥漫性的脂质空泡；造模同时给予依替米贝和辛伐他汀干预后,与2.5%高脂高胆固醇组相比,幼鱼肝细胞脂肪变性情况有一定程度的减轻。第三章非酒精性脂肪肝发病机制和药物作用机制的探讨第一部分非酒精性脂肪肝发病机制的探讨1.高脂饲料和高脂联合高胆固醇饲料喂食对脂质代谢相关基因表达水平的影响喂食10天后,fasn,hmgcra mRNA表达量在高脂组较对照组的表达水平显著下降,具有统计学意义(P<0.05)：与对照组相比,pparab,cpt1α和icox3 mRNA表达量显著增高,具有统计学意义(P<0.01)；其他基因表达和对照组无差异。与对照组相比,acaca, fasn, srebf2, hmgcsl和hmgcra mRNA在两个不同浓度高脂高胆固醇组表达量均显著下降(P<0.05), pparab,cpt1α和acox3 mRNA表达量显著增高(P<0.05)。2.高脂饲料和高脂联合高胆固醇饲料喂食对内质网应激相关基因表达水平的影响喂食10天后,与对照组相比,atf6,ern2, hspa5和hsp90bl mRNA在高脂组的表达量显著增高,具有统计学意义(P<0.05),而eif2ak3和ddit3在两组间表达无差异(P>0.05)。与对照组相比,两个浓度的高脂高胆固醇组atf6, hspa5和hsp90blmRNA表达量均显著增高,具有统计学意义(P<0.001)。喂食20天后,与对照组相比,内质网应激相关基因atf6, hspa5, hsp90bl和ddit3 mRNA在高脂组和高脂高胆固醇组的表达量显著增高,具有统计学意义(P<0.05)。3.高脂饲料和高脂联合高胆固醇饲料喂食对炎症因子表达水平的影响喂食10天后,il6 mRNA在5.0%高脂高胆固醇组的表达量较对照组升高,具有统计学差异(P=0.005),其他基因在各组中表达均无统计学差异(P>0.05)。喂食20天后,与对照组相比,炎症因子tnfa, il1b和il6 mRNA在高脂组表达量显著增高,具有统计学意义(P<0.05)；与高脂组相比,高脂高胆固醇组的上调的更为显著。第二部分依替米贝、辛伐他汀对NALFD斑马鱼保护作用的机制探讨1.依替米贝、辛伐他汀对胆固醇合成关键基因srebf2, hmgcsl和hmgcra mRNA表达量的影响与对照组相比,2.5%高脂高胆固醇组srebf2, hmgcsl和hmgcra mRNA表达水平显著降低,具有统计学差异(P<0.01)；与对照组相比,依替米贝干预组srebf2, hmgcsl和hmgcra mRNA表达量无统计学差异(P>0.05)；与对照组相比,辛伐他汀干预组表达水平显著降低,具有统计学差异(P<0.01)。可见,依替米贝干预后可以有效逆转高脂高胆固醇喂食引起的srebf2, hmgcsl和hmgcra的表达下调,而辛伐他汀干预后效果不明显。2.依替米贝、辛伐他汀对脂质分解关键基因pparab,cpt1α,acox3 mRNA表达量的影响与对照组相比,2.5%高脂高胆固醇组pparab, cpt1α和acox3 mRNA表达水平显著升高,具有统计学差异(P<0.01); pparab, cpt1α和acox3 mRNA表达量在2.5%高脂高胆固醇组和依替米贝干预组间无显著差异(P> 0.05)。acox3 mRNA表达量在2.5%高脂高胆固醇组和辛伐他汀干预组间有显著差异(P=0.018),而pparab和cpt1α mRNA表达量在2.5%高脂高胆固醇组和辛伐他汀干预组间无显著差异(P>0.05)。3.依替米贝、辛伐他汀对内质网应激关键基因atf6,hspa5,hsp90bl mRNA表达量的影响与对照组相比,2.5%高脂高胆固醇组atf6, hspa5和hsp90bl mRNA表达水平显著升高,具有统计学差异(P<0.001)；与2.5%高脂高胆固醇组相比,atf6, hspa5和hsp90bl mRNA表达量在依替米贝干预组显著降低(P<0.05)。与2.5%高脂高胆固醇组相比,atf6, hspa5和hsp90bl mRNA表达量在辛伐他汀干预组也显著降低(P<0.05)。4.依替米贝、辛伐他汀对内质网应激关键蛋白GRP78/BiP表达量的影响与对照组相比,2.5%高脂高胆固醇组能够显著诱导内质网关键蛋白GRP78/BiP的表达增加；与2.5%高脂高胆固醇组相比,依替米贝和辛伐他汀干预后,GRP78/BiP蛋白的表达量有所下降。结论1.本研究通过高脂饲料和高脂联合高胆固醇饲料的喂食的方法在国内外首次成功地建立了非酒精性脂肪肝斑马鱼幼鱼模型。2.两种降脂药物依替米贝和辛伐他汀可以有效改善高脂高胆固醇饲料喂食诱导的幼鱼脂肪肝,其作用机制可能是通过调节脂质代谢相关通路和内质网应激关键基因和蛋白的表达从而有效地改善幼鱼脂肪肝。3.斑马鱼幼鱼是活体研究非酒精性脂肪肝和进行相关药物筛选的有效的临床前模式生物,本研究为进一步开展在体降脂新药的筛选提供了新的实验思路。