帕金森病(Pakinson disease, PD)是一种多发于中老年人的缓慢进展的神经退行性疾病,目前了解的主要病理变化是黑质多巴胺(dopamine, DA)神经元的变性,进而导致黑质致密部内DA及其代谢产物3,4-二羟基苯乙酸(3,4-dihydroxyphenylacetieaeid, DOPAC)含量明显减少。但其发病的确切分子机理尚不清楚,使得对帕金森病的诊断和治疗有一定的盲目性,造成疗效的不确定和愈后不良。动物模型仍是研究帕金森病及其发病机制的重要工具,但目前构建动物模型的成功率不高、稳定性较差,在一定程度上影响了该病的深入研究。酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase, TH)是多巴胺(dopamine, DA)合成的限速酶,是神经系统内多巴胺能神经元的蛋白标志,其缺乏或减少可能是帕金森病发病的主要原因。本实验通过选用不同品系、不同体重的大鼠采用脑内单点或双点注射6-羟多巴胺的方法构建大鼠的帕金森病模型,根据动物的行为学表现及特异性酪氨酸羟化酶的表达变化,比较影响模型成功率的因素,筛选出表现稳定、高成功的模型制作技术,为帕金森病相关研究提供合适的动物模型。同时本实验采用荧光定量PCR的方法测定大鼠脑内TH mRNA的水平,研究脑内TH与帕金森病的发病关系,探索帕金森病发病的分子机制,为临床上帕金森病的分子诊断、治疗及其相关研究提供实验依据。实验一帕金森病大鼠模型构建技术的优化选用不同体重、不同品系的大鼠(Wistar/SD)作为实验对象,脑内单点或双点注射6-羟多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)的方法制备PD模型大鼠。术后2周起颈部皮下注射阿扑吗啡(Apomorphine, APO)诱导大鼠转圈,平均旋转圈数>7r/min判断为成功模型。同时通过HE染色和免疫组织化学染色法检测大鼠脑组织内酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase, TH)的表达变化。根据动物的行为学表现及特异性酪氨酸羟化酶表达变化,比较影响模型成功率、稳定性的因素,建立表现稳定、高成功的模型制作技术。术后2周对实验大鼠进行颈部皮下注射APO诱导转圈,大鼠出现明显的首尾相连的转圈行为。经统计学分析,单点注射6-OHDA构建的PD大鼠模型其成功率显著性的高于双点；选用体重为180g-240g大鼠构建的PD模型其成功率显著性的高于选用250g以上的大鼠；而选用SD和Wistar大鼠构建的PD模型其成功率无显著性差异。选用单点构建的PD模型其稳定性高于双点；选用不同体重的大鼠构建的PD模型其稳定性存在差异；选用不同品系的大鼠(Wistar/SD)构建的PD模型其稳定性不存在差异。HE染色和TH免疫组化结果表明帕金森病与纹状体内神经元的减少有关,特别是TH阳性细胞数量的减少,明显影响了多巴胺的合成。因此以体重为180g-240g的大鼠、脑内单点注射6-OHDA的方法构建大鼠帕金森病模型成功率高、稳定性好。实验二帕金森病模型大鼠脑内TH表达变化的实验研究本实验采用荧光定量PCR的方法测定大鼠脑内TH mRNA的水平,通过正常大鼠脑内TH mRNA表达水平的变化研究模型大鼠脑内TH mRNA表达水平的变化,分析THmRNA水平与帕金森病的关系,同时结合论文第一部分中免疫组织化学染色检测大鼠脑组织内酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase, TH)的表达变化,研究TH与帕金森病的关系,为临床上帕金森病的分子诊断和治疗提供实验依据。正常大鼠左右脑TH基因的表达无显著性差异,术后3周的成功帕金森病大鼠损毁侧脑(右脑)TH mRNA的表达量约是对照侧脑(左脑)的57.4%;术后6周的成功帕金森病大鼠损毁侧脑TH mRNA的表达量约是对照侧脑的31.7%,术后8周的成功帕金森病大鼠损毁侧脑TH mRNA的表达量约是对照侧脑的39.9%。研究论文第一部分中TH免疫组化结果显示PD模型大鼠损毁侧脑(右脑)内TH阳性细胞数明显减少,提示帕金森病与酪氨酸羟化酶的减少有关。本实验通过荧光定量PCR的方法对模型大鼠脑内TH mRNA表达水平的变化进行定量分析并结合论文第一部分中对脑内TH的免疫组化分析,可知帕金森病与脑内TH量的减少有关。本实验为临床上帕金森病的分子诊断和治疗提供了新的思路,例如通过转染TH基因治疗帕金森病等。