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蛋白质在层析介质表面的偶联位点是影响蛋白配基空间取向及其生物活性的关键因素,并进一步影响亲和介质的分离性能,研究配基在介质表面的偶联位点识别方法并探索蛋白配基的空间取向控制对于提高亲和介质性能具有重要意义。本论文探索了基于HPLC-MS和蛋白酶解技术的偶联位点识别方法,并在此基础上研究了活化过程以及偶联过程对模型蛋白偶联位点的影响,以及蛋白在介质表面偶联位点的控制方法,从分子水平上考察了影响配基偶联位点以及活性的关键因素。主要内容如下：(1)以溶菌酶为模型蛋白,建立了HPLC-MS技术与蛋白酶解技术相结合的层析介质表面上蛋白质偶联位点的识别方法。pH9.5时在环氧密度为22.34μmol/g(琼脂糖)介质表面偶联溶菌酶反应12h,利用HPLC-MS与蛋白酶解技术相结合识别出溶菌酶的偶联位点发生在K96、K97和K33,偶联位点比例为82%,16%和2%。证明了蛋白酶解结合多肽序列分析是一种有效的识别蛋白偶联位点的方法。(2)研究了不同反应条件下溶菌酶在介质表面偶联的位点变化,证明了环氧密度、偶联pH对蛋白配基偶联位点种类影响显著,环氧密度较低时可以实现单一位点偶联,增加环氧密度会使偶联位点数增多,偶联可控性降低；偶联pH影响蛋白配基的二级结构变化,甚至引发蛋白聚集效应,因此pH较高时会导致溶菌酶发生多位点偶联。以不同pH偶联的溶菌酶活性也存在一定差别,环氧密度为11.34μmol/g,pH9.5时溶菌酶的偶联位点单一,并接近酶的底物结合中心,因此活性最低,而增加或降低pH使溶菌酶以分散的多位点偶联在介质表面,可以使其活性增加。而偶联反应时间则影响蛋白配基在界面的偶联量,在偶联12h时可以使蛋白配基偶联量最大,但对偶联位点的种类无显著影响。(3)以牛血清白蛋白(BSA)和牛碳酸酐酶(CA)为模型蛋白,考察了pH11.0、环氧密度为22.34μmol/g(琼脂糖)介质表面上的两种模型蛋白的偶联位点,BSA的偶联位点分别为K180、K114、K20、K294、K474、K375、K173、K159、K312、K41等,而CA的偶联位点主要发生在K17、K223和K75。以HPLC-MS和蛋白酶切技术结合,可以有效识别不同蛋白在介质表面的偶联位点,偶联条件对蛋白偶联位点的影响研究表明介质活化时间和偶联反应pH是影响偶联位点的关键因素,可通过控制两种条件实现蛋白配基的位点可控性偶联。蛋白质疏水性分析证明了多肽的亲水性使之更易接近环氧活化的介质表面而发生偶联反应