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目的:对重组多肽CS5931的制备工艺进行优化,并研究其体内外抗结肠癌的作用,为将来的中试放大和药理学研究提供依据和实验基础。方法:1.以p ET28a为载体质粒,以大肠杆菌BL21(DE3)为表达菌株,构建质粒p ET28a-CS5931和p ET28a-DDDK-CS5931并分别转化到表达菌株中,进行重组多肽CS5931和CS5931-EK的表达;将发酵所得菌体裂解后进行超声破碎离心处理,利用镍柱亲和层析法、使用仪器AKTA-Purifier 100进行多肽的分离纯化;利用SDS-PAGE和Western blot法检测重组多肽CS5931和CS5931-EK的表达。2.以大肠杆菌BL21(DE3)/p ET28a-CS5931为发酵菌株,从碳源、氮源、磷酸盐、Mg2+、诱导剂异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的浓度、诱导温度、诱导时间等方面优化表达体系的发酵制备工艺。利用Plackett-Burman实验筛选出对重组多肽CS5931的表达影响最大的3个因素,并结合单因素实验结果设计响应面实验,通过中心组和实验(CCD)结果筛选出3个因素的最佳组合。3.利用单因素实验优化复性液成分,包括小分子物质甘油、尿素和谷胱甘肽,并检测了利用优化后的复性液进行复性所制备重组多肽CS5931的表达量及抗结肠癌细胞HCT116增殖的活性。4.利用MTT法评价重组萨氏海鞘多肽CS5931和CS5931-EK对体外结肠癌细胞HCT116的增殖抑制作用。建立人结肠癌细胞HCT116裸鼠移植瘤模型,并利用该模型考察重组萨氏海鞘多肽CS5931的体内抗结肠癌作用。结果:1.成功构建了p ET28a/CS5931质粒和p ET28a-DDDK-CS5931质粒并表达了重组多肽CS5931和CS5931-EK。重组多肽CS5931经分离纯化后呈单一条带,且纯度可达到98%。重组多肽CS5931和CS5931-EK的表达量分别为每升发酵液2.0 mg和1.5 mg。2.发酵制备工艺优化后的最佳发酵条件为酵母提取物浓度30 g/L,甘油浓度0.45%,IPTG浓度0.75 m M,诱导温度16℃,诱导时间20 h。优化后重组多肽CS5931的表达量从2.0 mg/L提高到7.5 mg/L,与优化前相比提高了2.75倍。3.优化后的复性液能够显著提高重组多肽CS5931的抗结肠癌细胞HCT116增殖的活性,对人结肠癌细胞HCT116的半数抑制浓度IC50值从23.2μM下降到11.6μM(活性增强1倍)。优化后复性液组分确定为50 m M Tris,0.5 m M EDTA,50 m M Na Cl,0.5 m M L-精氨酸,5%甘油,2 M尿素和2 m M/0.2 m M GSH/GSSH。4.所制备的重组多肽CS5931和CS5931-EK都具有显著的体外抗结肠癌细胞增殖的活性,His-tag的有无对重组多肽的抗结肠癌作用没有明显影响。体内实验表明重组多肽CS5931在25 mg/kg剂量时显著抑制人结肠癌HCT116裸鼠移植瘤的生长,且抗癌效果呈剂量依赖性,在同剂量(50 mg/kg)下抗癌效果优于阳性对照药环磷酰胺(CTX),同时用药期间未发现动物死亡,显示该重组多肽具有一定的安全性。结论:1.通过单因素实验,Plackett-Burman实验和中心组和实验对重组多肽CS5931的制备工艺进行了优化。使用优化后的工艺制备重组多肽CS5931,表达量从2.0 mg/L提高到7.5 mg/L,与优化前相比提高了2.75倍。复性液优化后可显著提高重组多肽CS5931的体外抗结肠癌细胞增殖活性,且His-tag的有无对重组多肽CS5931的抗结肠癌作用没有明显影响。2.所制备的重组多肽CS5931具有较好的体外和体内抗结肠癌作用,体外可显著抑制人结肠癌细胞HCT116的增殖;体内可显著抑制HCT116裸鼠移植瘤的生长,提示在结肠癌的治疗方面具有潜在的应用前景。