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本课题为创伤后深静脉血栓形成(Deep Venous Thrombosis, DVT)系列研究的一部分,在基于课题组前期动物建模方法的探索及基因芯片技术对相关基因筛选工作的基础上,我们发现炎性因素与DVT之间关系密切。结合经典文献关于DVT的研究,本课题就巨噬细胞炎性蛋白-1α (Macrophage Inflammatory Protein-1α, MIP-1α)及其调控的单核/巨噬细胞、基质金属蛋白酶2/9(MatrixMetalloproteinase-2/9, MMP-2/9)在DVT形成及溶解中的作用,对经结扎下腔静脉造模的淤滞型小鼠DVT模型血液、静脉壁和血栓栓子以及人血液中与DVT形成及溶解关系密切的MIP-1α、F4/80、MMP-2、-9的表达变化和其作用作一初步研究。目的：1.以结扎下腔静脉法建立淤滞型小鼠DVT模型,参照经典文献的报导,设立不同的时间点,获取相应时间点造模小鼠心脏血液、下腔静脉和血栓组织,HE染色观察造模小鼠建模后DVT形成的具体时间点,RT-PCR、 ELISA法检测其血液中MIP-1α在DVT形成前后的表达变化；2.应用MIP-1α中和抗体(rh-MIP-1α Ab)腹腔注射建模后DVT形成的小鼠,明确其是否具有促进DVT溶解的作用；同时以RT-PCR、ELISA法检测不同组别造模后小鼠在预设时间点MIP-1α、 MMP-2、-9的表达变化,免疫组化法检测静脉壁和血栓栓子中巨噬细胞表面特异性抗原F4/80的表达,初步明确MIP-1α与DVT形成及溶解的关系,进而初步探讨其与血栓形成及溶解的相关机制；3.对不同分组的人群血液样本,提取全血中MIP-1α、 F4/80、MMP-2、-9的mRNA,检测其在人血中的表达变化,探讨不同血栓形成状态下所关注的MIP-1α、 F4/80、 MMP-2、-9基因的表达变化及其与DVT的相关性。方法：1.96只昆明种小鼠参照随机数字表分为对照组(n=8)和模型组(n=88),模型组采用结扎下腔静脉法建立淤滞型小鼠DVT模型,参照经典文献报道,在建模后设立2h、4h、6h、8h、12h、1d、2d、4d、8d、14d、21d等11个时间点,在每个时间点将8只造模后小鼠麻醉后行心脏采血,同时获取造模段长约1.0cm的下腔静脉组织。将获取的小鼠血液样本以RT-PCR, ELISA法检测MIP-1α的表达,获取的下腔静脉组织以石蜡包埋后行静脉组织冠状面组织切片,观察血栓形成情况。2.再取152只昆明种小鼠参照随机数字表分为对照组(n=8)和模型组(n=144),模型组采用结扎下腔静脉法建立淤滞型小鼠DVT模型,参照经典文献报道,造模后将模型组小鼠随机分为DVT组(n=72,小鼠不加任何干预措施)及DVT+MIP-1α-Ab组(n=72,小鼠造模后予以MIP-1α中和抗体0.5m1持续腹腔注射7d)；建模后设立2d、4d、8d、12d、14d、21d等6个时间点,在每个时间点将12只造模后小鼠过量麻醉后处死,获取造模段的下腔静脉组织。质量/长度比值评估血栓的溶解程度,应用RT-PCR及ELISA法检测造模段静脉及血栓组织中MIP-1α、MMP-2、-9的表达量；同时免疫组化法检测相应时间点静脉壁及血栓组织中巨噬细胞表面特异抗原F4/80的表达。3.采集人血并依据诊断(详见附表2)分为血栓组、血栓未形成组和健康对照组,用Paxgene blood RNA kit试剂盒提取mRNA,胶回收测序证实PCR所扩增基因准确,后以real-time PCR定量检测、统计学分析不同组间MIP-1α、F4/80、MMP-2、-9mRNA的表达。对于临床一般资料、血细胞检验、血生化检验、凝血指标和彩色多普勒超声检查等的结果进行搜集、统计,结合mRNA的表达结果进行综合分析。结果：1.结扎下腔静脉法建立小鼠淤滞型DVT模型,HE组织染色显示在6h时间点小鼠下腔静脉中有部分血栓形成,8h时间点有完全性血栓形成,与血管壁粘连；血栓主要为均匀分布的红细胞,其间可见纤维素网状结构及散在的血小板及白细胞；在14d时间点可见血栓明显机化缩小。2.模型组小鼠MIP-1α mRNA、蛋白在血液中的表达呈造模后8h、12h、1d、2d、4d、8d逐渐升高的趋势(P<0.05),8d达到峰值(P<0.01),21d降至正常水平(P>0.05)。3.DVT组及DVT+MIP-1α-Ab组血栓质量/长度比值随时间的延长呈逐渐缩小的趋势(P<0.05),相同时间点DVT组血栓栓子质量/长度比值减小更为明显(P<0.05)。4.相同时间点DVT组F4/8、MMP-9的表达明显高于DVT+MIP-1α-Ab组(P<0.05), MMP-2的表达相同时间点组间无差异(P>0.05)。5.PCR电泳检测半定量分析及Real-time PCR定量检测人血MIP-1α、 F4/80、MMP-2、-9mRNA在血栓组中的表达显著高于血栓未形成组和健康对照组,血栓未形成组的表达量与健康对照组无差别。结论：1.结扎下腔静脉法建立淤滞型小鼠DVT模型在8h左右可形成完全性血栓,14d左右血栓可发生明显机化。2.小鼠DVT模型血液中MIP-1α的表达在建模后8d达到最高值,21d降至正常水平。3. MIP-1α与深静脉血栓溶解密切相关,其中和抗体可减弱MIP-1α促进血栓溶解的效应。4. MIP-1α促进血栓溶解的作用与单核/巨噬细胞聚集、MMP-9的表达密切相关,MMP-2与血栓溶解的关系可能是独立于MIP-1α之外存在的。5. MIP-1α、F4/80、MMP-2、-9mRNA在人群中DVT形成后的血液中呈高表达,结合MIP-1α较强的诱导单核/巨噬细胞向损伤部位聚集、及诱导MMP-9表达的作用,提示MIP-1α可能参与了DVT的形成、溶解过程。