胶质细胞瘤是一种颅内原发性肿瘤,其发病率高,占所有颅内肿瘤的50%以上。由于胶质瘤呈浸润性生长,侵袭性强,所以手术难以完全切除,治疗效果差,往往预后不良。WHO将胶质瘤分为4级,级别越高则恶性程度就越高。其中级别最高的胶质母细胞瘤(GBM)为WHO Ⅳ级,该肿瘤发病率高,约占到所有颅内肿瘤的15%。在胶质母细胞瘤尽可能手术切除的前提下,再辅以标准的放化疗,病人的中位生存期仍然不超过15个月。近年来的研究表明,胶质瘤,特别是恶性程度最高的胶质母细胞瘤中含有一种细胞亚群,这种细胞亚群拥有部分正常干细胞的特性,被称为胶质瘤干细胞(glioblastoma stem-like cells,GSCs)。GSCs起到了极强的促进胶质母细胞瘤增殖的作用,同时GSCs在促进肿瘤向颅内周围脑组织浸润、扩散的过程中起到了关键作用。目前手术综合放化疗并不能有效的杀灭GSCs,这导致肿瘤往往会较快复发,预后不良,所以亟需探索能够有效杀灭GSCs的治疗手段。褪黑素是一种由松果体分泌的激素。长期以来,褪黑素一直被认为是一种调节生物节律的激素,而近年来越来越多的研究证明,褪黑素对多种肿瘤均具有抑制作用,其中便包括胶质瘤。然而褪黑素对GSCs的作用还少有研究,其机制也尚不明确。EZH2具有组蛋白甲基化转移酶作用,是多梳蛋白复合体2的组分之一。在包括胶质瘤、乳腺癌、胃癌、结肠癌在内的多种肿瘤中,均发现了 EZH2的异常升高。并且EZH2的表达量越高,肿瘤往往恶性程度越高,预后越发不良,而抑制EZH2的表达能够延缓肿瘤的发生和发展。同时已经有确切证据表明,EZH2是GSCs的干性指标之一。NOTCH受体的过表达也存在于包括胶质瘤在内的多种恶性肿瘤中。EZH2-NOTCH1信号轴已经被证明存在于胰腺癌中,而EZH2-NOTCH1信号轴是否也存在于GSCs中,同时是否参与了褪黑素对GSCs的作用还尚没有报道。本实验主要研究了褪黑素对GSCs的作用及具体的作用机制。目的:1、研究褪黑素对GSCs增殖、自我更新及干性的作用;2、研究EZH2-NOTCH1信号轴在褪黑素起效过程中发挥的具体作用;3、研究EZH2对NOTCH1调控中的具体作用机制。方法:第一部分:褪黑素对GSCs增殖、自我更新及干性的影响1、U251和T98细胞系中GSCs的培养及验证1.1在干细胞富集培养基(无血清,加入B27,bFGF和EGF因子)培养U251和T98G细胞系,培养至少三周,建立GSCU251和GSCT98G细胞模型。1.2 qRT-PCR检测GSCs干细胞标记物CD133和SOX2的含量,验证GSCU251和GSCT98G细胞模型是否建立成功。2、检测不同浓度褪黑素对GSCs的生存、增殖能力的影响2.1配制含有不同浓度褪黑素(0.1-1000μM)的培养基,培养GSCU251和GSCT98G。2.2 CCK-8实验检测不同浓度褪黑素对GSCU251和GSCT98G增殖能力的影响。3、检测褪黑素其对GSCs自我更新能力的影响通过成球实验检测不同浓度褪黑素对GSCU251和GSCT98G自我更新能力的影响。4、检测褪黑素对GSCs干性的影响qRT-PCR和Western Blot检测褪黑素对GSCU251和GSCT98G中干性标记物CD133和SOX2表达的影响。第二部分:EZH2在褪黑素对GSCs的抑制过程中的作用探究1、检测褪黑素对GSCs中EZH2表达的影响。qRT-PCR和Western Blot检测褪黑素对GSCs中EZH2表达的影响。2、EZH2敲除GSCU251模型的建立2.1通过EZH2 shRNA转染GSCU251,建立EZH2敲除GSCU251模型。2.2 Western Blot检测EZH2敲除GSCU251模型建立是否成功。3、检测EZH2敲除后GSCU251的增殖能力、自我更新能力及干性的变化敲除GSCU251中的EZH2后,CCK-8实验检测GSCU251的生长、增殖能力变化;成球实验检测GSCU251的自我更新能力变化;qRT-PCR检测GSCU251中CD133分子表达的变化。4、EZH2过表达GSCU251模型的建立4.1通过GV230-EZH2质粒转染GSCU251,中建立EZH2过表达GSU251模型。4.2 Western Blot检测EZH2过表达GSCU251模型建立是否成功。5、检测EZH2过表达后GSCU251的增殖能力、自我更新能力及干性的变化GSCU251中的EZH2过表达后,CCK-8实验检测GSCU251的生长、增殖能力变化;成球试验检测GSCU251的自我更新能力变化;qRT-PCR检测GSCU251中CD133分子表达的变化。6、检测褪黑素加入后,对照组和EZH2过表达组GSCU251的增殖能力、自我更新能力及干性的变化6.1在对照组GSCU251中加入褪黑素进行培养,CCK-8、成球实验检测GSCU251的增殖能力、自我更新能力变化;qRT-PCR检测GSCU251中CD133分子表达的变化。6.2在EZH2过表达组GSCU251中加入褪黑素进行培养,CCK-8、成球实验检测GSCU251的增殖能力、自我更新能力变化;qRT-PCR检测GSCU251中CD133分子表达的变化。第三部分:NOTCH1在EZH2起效过程中的作用及机制1、检测褪黑素对GSCs中NOTCH1表达的影响1.1 qRT-PCR检测褪黑素干预后GSCU251和GSCT98G中NOTCH1及下游因子CCND1,CCNE2和HES1等的mRNA表达量变化。1.2 Western Blot 检测褪黑素干预后 GSCU251 和 GSCT98G 中 NICD1(NOTCH1的胞内功能区域)和HES1的蛋白表达量变化。2、检测EZH2对NOTCH1的调控作用2.1通过双荧光素酶报告实验检测EZH2敲除和过表达GSCU251中NOTCH1转录活性的变化。2.2 Western Blot检测EZH2敲除和过表达GSCU251中NICD1和HES1的蛋白表达量变化。2.3染色质免疫共沉淀实验检测GSCU251中NOTCH1的启动子位置EZH2、H3K27me3和SUZ12的聚集情况。第四部分:EZH2-NOTCH1信号轴在临床样本中的初步探究1、检测胶质母细胞瘤样本和正常脑组织样本中EZH2和NICD1表达的相关性1.1选取67例胶质母细胞瘤样本和12例正常脑组织样本进行EZH2和NICD1指标的免疫组化染色。1.2统计学分析胶质母细胞瘤样本中EZH2和N1CD1的表达相关性。结果:第一部分:褪黑素对GSCs增殖、自我更新及干性的影响1、U251和T98细胞系中GSCs的培养及验证通过干细胞富集培养基培养U251和T98G细胞系三周后,建立GSCU251和GSCT98G细胞模型。通过qRT-PCR检测,我们发现,与普通U251和T98G细胞系相比,GSCU251和GSCT98G细胞模型的干细胞标记物CD133和SOX2的含量明显升高。2、检测不同浓度褪黑素对GSCs的生存、增殖能力的影响不同浓度褪黑素处理GSC251和GSCT98G后,CCK-8实验结果显示,100μM和1mM的褪黑素对GSCs的生长产生了抑制作用。3、检测褪黑素其对GSCs自我更新能力的影响不同浓度褪黑素处理GSCU251和GSCT98G后,成球实验结果显示,100μM和1mM的褪黑素对GSCs的自我更新产生了抑制作用。4、检测褪黑素对GSCs干性的影响qRT-PCR和Western Blot检测结果表明,1mM的褪黑素对GSCU251和GSCT98G中干性标记物CD133和SOX2表达有明显的抑制作用。第二部分:EZH2在褪黑素对GSCs的抑制过程中的作用探究1、检测褪黑素对GSCs中EZH2表达的影响。qRT-PCR和Western Blot检测结果表明,褪黑素的干预显著降低了 GSCU251和GSCT98G中EZH2的表达量。2、EZH2敲除GSCU25,模型的建立通过EZH2 shRNA转染GSCU251,建立EZH2敲除GSCU251模型后,Western Blot实验表明,EZH2敲除GSC251模型中的EZH2蛋白表达量明显降低。3、检测EZH2敲除后GSCU251的增殖能力、自我更新能力及干性的变化敲除GSCU251中的EZH2后,CCK-8实验表明,GSCU251的生长、增殖能力显著降低;成球实验表明,GSCU251的自我更新能力显著降低;qRT-PCR检测显示,GSCU251中CD133分子表达量显著下降。4、EZH2过表达GSCU251模型的建立通过GV230-EZH2转染GSCU251,建立EZH2过表达GSCU251模型后,Western Blot实验表明,EZH2过表达GSCU251模型中的EZH2蛋白表达量明显升高。5、检测EZH2过表达后GSCU251的增殖能力、自我更新能力及干性的变化GSCU251中的EZH2过表达后,CCK-8实验表明,GSCU251的生长、增殖能力显著增强;成球实验表明,GSCU251的自我更新能力显著增强;qRT-PCR检测显示,GSCU251中CD133分子表达量显著升高。6、检测褪黑素加入后,对照组和EZH2过表达组GSCU251的增殖能力、自我更新能力及干性的变化6.1对照组GSCU251中加入褪黑素进行培养后,CCK-8、成球实验结果显示,GSCU251的增殖能力、自我更新能力显著下降;qRT-PCR检测表明,GSCU251中CD133的表达量明显降低。6.2 EZH2过表达组GSCU251中加入褪黑素进行培养后,CCK-8、成球实验结果显示,GSCU251的增殖能力、自我更新能力显著下降;qRT-PCR检测表明,GSCU251中CD133的表达量明显降低。第三部分:NOTCH1在EZH2起效过程中的作用及机制1、检测褪黑素对GSCs中NOTCH1表达的影响1.1 qRT-PCR检测结果显示,褪黑素干预后GSCU251和GSCT98G中NOTCH1及下游因子CCND1,CCNE2和HES1等的mRNA表达量显著下降。1.2 Western Blot检测结果也表明,褪黑素干预后GSCU251和GSCT98G中NICD1和HES1的蛋白表达量显著下降。2、检测EZH2对NOTCH1的调控作用2.1通过双荧光素酶报告实验,我们发现,GSCU251中的EZH2敲除和过表后,NOTCH1转录活性随之减弱和增强。2.2 Western Blot结果表明,GSCU251中EZH2敲除和过表达后,NICD1和HES1的蛋白表达量也随之升高和降低。2.3染色质免疫共沉淀实验检测发现,GSCU251中NOTCH1的启动子位置可以检测到EZH2的显著聚集,而并未检测到H3K27me3和SUZ12的聚集。同时,褪黑素的干预显著降低了 EZH2在NOTCH1的启动子区域的聚集。第四部分:EZH2-NOTCH1信号轴在临床样本中的初步探究1、检测胶质母细胞瘤样本和正常脑组织样本中EZH2和NICD1表达的相关性1.1免疫组化染色结果显示,73%的EZH2高表达胶质母细胞瘤样本中也存在着NICD1的高表达。1.2统计学分析发现,胶质母细胞瘤样本中EZH2和NICD1的表达存在高度的正相关。结论:1、特定浓度的褪黑素对GSCs增殖、自我更新能力具有显著地抑制作用,并能显著降低GSCs的干性。2、通过机制实验,我们发现,褪黑素通过抑制EZH2-NOTCH1信号轴发挥了抑制GSCs的作用。3、EZH2-NOTCH1信号轴中,EZH2通过直接结合NOTCH1的启动子区域调控NOTCH1的表达。