家蚕二分浓核病毒（Bombyx mori bidensovirus，BmBDV）是2012年新建二分DNA病毒科（family Bidnaviridae）的代表种，是首例动物二分体病毒。BmBDV特异地感染家蚕中肠柱状上皮细胞，感染家蚕表现出浓核病症。BmBDV的病毒粒子，没有囊膜包被，呈正二十面体型，直径约22-24nm。BmBDV基因组包括两个单链DNA分子，分别包装到两个病毒粒子中。DNA分子的末端有反向末端重复，里面没有回文序列，不能形成发卡结构，DNA不能像细小病毒采取滚环复制的方式。BmBDV自身编码一个B家族DNA聚合酶，基因组末端可以形成“锅柄形”结构，可能采取类似腺病毒的以蛋白为引物的DNA复制模式。BmBDV兼具浓核病毒及腺病毒的双重特性，在作为载体方面有很大的潜能。　　先前研究结果表明BmBDV基因组克隆线性化后转染BmN细胞，已经实现了该病毒的拯救。在病毒拯救的基础上，要研究BmBDV作为表达载体，首先要研究它是否具有容纳外源基因的能力。BmBDV的非结构蛋白NS1的启动子是一个早期启动子，在病毒感染的早期就有活性。BmBDV主要结构蛋白VP和次要结构蛋白mCP，同非结构蛋白的启动子活性相比，结构蛋白的启动子活性更强。在本研究中，选择报告基因egfp作为外源基因，插入到病毒的非结构蛋白基因、主要结构蛋白基因以及次要结构蛋白基因的编码框中，构建了BmBDV重组病毒。在细胞水平上对重组病毒在昆虫细胞中的表达情况进行了研究，并且对BmBDV在哺乳动物细胞中的感染性进行了初步探索。　　1.病毒的非结构蛋白基因与egfp融合的重组病毒　　BmBDV的非结构蛋白ns1基因的启动子P5是一个早期启动子，在病毒感染的早期就能起始ns1基因的转录，所以我们首先选择非结构蛋白基因作为egfp插入的位点。本章中，将egfp基因插入到非结构蛋白ns1基因的C末端，成功构建了egfp基因与病毒的非结构蛋白基因融合的重组质粒pVD1-NS1GFPf。线性重组病毒DNA转染昆虫细胞，在生物学水平和分子生物学水平对重组病毒进行了鉴定。　　2.病毒的主要结构蛋白基因与egfp融合的重组病毒　　VP蛋白是BmBDV的主要结构蛋白，是构成病毒衣壳的主要成分，在宿主细胞中的表达量很高，启动子活性比较强。本研究中egfp基因插入到vp基因的内部以及C末端，成功构建了重组质粒pVD1-VP/GFP和pVD1-VPGFPf。将重组DNA从环形质粒上释放后转染昆虫细胞，在细胞水平上对主要结构蛋白融合报告基因的重组病毒进行了鉴定。　　3.病毒的次要结构蛋白基因与egfp融合的重组病毒　　除了VP蛋白之外，BmBDV还能编码次要结构蛋白mCP，在本章研究中egfp基因插入到mCP基因内部，成功构建了次要结构蛋白基因与egfp融合的重组质粒pVD2-mCP/GFP。酶切后获得的线性重组DNA转染昆虫细胞，对其进行分子生物学水平鉴定，可以检测到病毒DNA的复制和主要结构蛋白VP的表达。　　4.BmBDV对哺乳动物细胞感染性的检测　　研究发现，BmBDV的P5启动子在HeLa细胞中具有活性，就此我们研究了BmBDV在哺乳动物细胞中的复制和表达情况。本研究中将线性化的BmBDV基因组以及构建的带egfp标签的重组病毒DNA转染HEK293细胞，分子水平上没有检测到病毒DNA的复制和主要结构蛋白的表达。该结果初步说明BmBDV对哺乳动物细胞没有感染性。　　本研究最后得出结论，构建重组BmBDV时报告基因和病毒的次要结构蛋白mCP基因融合时对病毒的影响最小，初步研究结果表明BmBDV对哺乳动物细胞没有感染性。