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研究背景石墨烯材料是研究人员2004年发现的新型纳米材料,被誉为“黑金”,在生物材料等领域具有良好的应用前景。石墨烯及其主要衍生物氧化石墨烯(Graphene oxide,GO)和还原型氧化石墨烯(Reduced graphene oxide,rGO)可应用于生物成像、药物和基因载体、组织工程学等。在口腔医学领域,石墨烯材料也有广阔的应用前景。通过使用石墨烯衍生物对种植体和义齿基托改性可极大地改善传统材料的性能;石墨烯氧化物还可以用作抗菌药物或细菌的远程检测。但是,石墨烯家族对人体产生的潜在毒性日益引起关注,有研究证实,纳米级尺寸的石墨烯材料能通过静脉注射、吸入等多种途径进入机体,穿过血脑屏障进入大脑,并导致神经毒性损伤,但具体致病机制尚不明确。研究目的本研究使用PC12细胞系建立神经元细胞模型,通过给予GO和rGO处理,探究石墨烯氧化物的细胞毒性强度;进一步探讨相同浓度剂量下两种石墨烯氧化物对细胞周期改变和凋亡产生的影响及相关机制。材料与方法第一章:GO和rGO的表征检测和细胞毒性作用1.原子力显微镜(Atomic force microscopy,AFM)检测GO和rGO的原始粒径和形态。拉曼光谱表征石墨烯材料的缺陷(D峰)、sp2碳原子的面内振动(G峰)和碳原子堆垛方式(G’峰)。动态光散射(Dynamic light scattering,DLS)检测纳米颗粒在混悬液中的水合粒径和Zeta电位。2.使用神经生长因子诱导PC12细胞神经元样改变,建立神经元模型。不同浓度的GO或rGO处理细胞后,使用CCK-8毒性-增殖实验检测细胞存活率;使用乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)释放检测试剂盒检测细胞上清中LDH的释放量和活性。第二章:GO和rGO诱导PC12细胞凋亡和细胞周期阻滞1.使用凋亡检测试剂盒检测GO和rGO对PC12细胞凋亡、坏死的影响。2.使用细胞周期检测试剂盒检测GO和rGO对PC12细胞周期的阻滞效应;使用免疫荧光法观察细胞分裂改变。第三章:GO和rGO诱导PC12细胞凋亡和细胞周期阻滞的相关机制研究1.使用透射电镜观察细胞内线粒体超微结构改变;流式细胞仪技术检测细胞内线粒体膜电位变化;ATP检测试剂盒检测细胞内ATP含量,活性氧(Reactive oxygen species,ROS)检测试剂盒检测细胞内ROS生成量。2.使用免疫荧光法观察GO和rGO对PC 12细胞内细胞骨架系统的影响。3.提取细胞内总RNA,逆转录后实时荧光定量PCR(Quantitativereal-time PCR,qPCR)检测凋亡及细胞骨架相关基因的表达变化。4.使用蛋白免疫印迹实验(Western-blot)检测GO和rGO干预对PC12细胞内骨架相关蛋白和ERK信号通路蛋白磷酸化水平的影响。结果1.AFM检测得本实验选用的GO和rGO为不规则片状、厚度在1 nm以内的纳米材料;拉曼光谱检测到GO和rGO特征峰:G峰、D峰、G’峰;DLS结果显示GO平均粒径为219 nm,Zeta电位为-14.3±11.1 mV,rGO平均粒径是122.4 nm,Zeta 电位为-17.7±7.99 mV。2.成功诱导并建立PC12神经元模型。GO和rGO在相同浓度梯度下表现出不同的细胞毒性效应,并能诱导细胞内LDH释放到细胞外。3.高浓度的GO和rGO能诱导细胞凋亡坏死、细胞周期阻滞在G0/G1期、抑制细胞分裂。4.GO和rGO能损伤线粒体结构与功能,以及调控细胞内线粒体介导的凋亡相关基因的表达变化。5.GO和rGO能损伤细胞内微管、微丝系统,并调控细胞内微管、微丝相关基因和蛋白的表达变化。6.GO和rGO能调控ERK信号通路磷酸化水平。抑制ERK通路能一定程度的逆转细胞凋亡水平和细胞周期阻滞。结论GO和rGO能诱导PC12产生细胞毒性、释放LDH、细胞凋亡及坏死、细胞周期阻滞和抑制细胞分裂。其中,GO和rGO激活的线粒体损伤可能参与调控细胞凋亡坏死。GO和rGO诱导的细胞骨架系统损伤影响细胞周期和细胞分裂改变。ERK通路参与调控GO和rGO诱导的细胞凋亡和周期阻滞。