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研究背景二甲双胍是一种单磷酸腺苷依赖的蛋白激酶（Adenosine 5’-monophosphate（AMP）-activated protein kinase,AMPK）激活剂,可以改变肿瘤细胞的能量代谢状态。AMPK可以下调缺氧诱导因子1α（hypoxia inducible factor-1,HIF-1α）的表达。哺乳动物雷帕霉素复合物1（mammalian target of rapamycin complex 1,m TORC1）可以促进HIF-1α的表达,促进多种生物合成过程的发生。AMPK可以抑制m TORC1的表达。二甲双胍是否可以通过激活AMPK,抑制m TORC1,进一步作用于HIF-1α,使其表达下调,目前还没有实验证据支持。透明细胞肾细胞癌细胞具有典型的Warburg效应。在肾癌中GLUT1是mi RNA-1291的直接靶点。二甲双胍是否可以改变肿瘤细胞中mi RNA-1291的表达还没有人研究过。HIF-1α是糖酵解相关的多种基因的转录因子,HIF-1α作为AMPK下游的主要信号因子,在透明细胞肾细胞癌细胞中通常高表达。二甲双胍是否可以通过激活AMPK,抑制m TORC1进一步下调HIF-1α的表达,作用于GLUT1使其表达减少,来抑制肿瘤的糖酵解的进行,进而会对透明细胞肾细胞癌细胞的肿瘤生物学行为造成影响却未有报导。明确二甲双胍抑制糖酵解的机制对于临床应用有重要的意义。研究目的综上所述本课题提出假设,二甲双胍可能会通过激活AMPK,抑制m TORC1,进而抑制HIF-1α的表达,使肿瘤细胞的糖酵解过程速率下降来达到抗肿瘤的目的;并且二甲双胍还可能改变透明细胞肾细胞癌细胞中mi RNA-1291的表达,进而改变GLUT1的表达。本实验选用VHL基因为野生型的透明细胞肾细胞癌细胞ACHN和caki-1细胞进行实验,探究二甲双胍是否会通激活AMPK抑制m TORC1,进而下调HIF-1α的表达,改变其下游GLUT1的表达,通过抑制糖酵解的进行对肿瘤的生物学行为造成影响。并检测二甲双胍对肿瘤细胞中mi RNA-1291表达的影响。研究方法和结果第一部分:首先通过CCK8实验确定二甲双胍对透明细胞肾细胞癌细胞增殖的影响,并计算出IC50,依据IC50选取后续实验浓度;通过比色法试剂盒检测二甲双胍作用于肿瘤细胞后葡萄糖的吸收量的改变,乳酸的生量的改变,以这两种指标评价二甲双胍是否对肿瘤细胞的有氧糖酵解发挥抑制作用;并通过Weston blot检测二甲双胍作用后肿瘤细胞GLUT1的表达变化;通过比色法试剂盒检测二甲双胍作用后乳酸脱氢酶的活性变化。实验结果表明二甲双胍会抑制透明细胞肾细胞癌细胞的糖酵解速率,并下调GLUT1的表达。但是二甲双胍会上调乳酸脱氢酶的活力。第二部分:利用划痕实验和Transwell实验,检测二甲双胍对肿瘤细胞的迁移和侵袭能力的影响;利用流式细胞术检测二甲双胍对于肿瘤细胞细胞周期的影响;利用Annexin V/PI法检测二甲双胍对肿瘤细胞凋亡的影响;通过Weston blot检测Ki67、Bax和Bcl2的表达变化。结果显示,二甲双胍可以抑制肿瘤细胞的增殖,迁移和侵袭,促进肿瘤细胞凋亡。第三部分:为了探索二甲双胍的作用机制,本章以实时荧光定量PCR（q RT-PCR）检测AMPK、m TORC1和HIF-1α在细胞中的RNA水平表达的变化;以Weston blot检测AMPK的蛋白质的表达水平以及AMPK磷酸化的水平,以此确定AMPK是否被活化;检测m TORC1和HIF-1α的蛋白表达水平的改变。结果表明,二甲双胍可在RNA水平上对于AMPK的表达有促进作用,对m TORC1和HIF-1α的表达有抑制作用;虽然二甲双胍对AMPK的翻译水平没有上调作用,但是二甲双胍可以促进AMPK的磷酸化以此活化AMPK,在蛋白水平上抑制m TORC1的表达,并下调HIF-1α的表达。第四部分:通过q RT-PCR检测HK2,ACHN和caki-1细胞中mi RNA-1291表达的差异,并检测不同浓度二甲双胍作用48h后ACHN和caki-1细胞中mi RNA-1291表达的改变。结果发现,在正常肾小管细胞HK2细胞中与肿瘤细胞ACHN和caki-1细胞中,mi RNA-1291表达存在显著的差异,肿瘤细胞中的表达会显著下调。二甲双胍作用后,肿瘤细胞中的mi RNA-1291表达有所上升,并且具有剂量依赖性。研究结论:1.二甲双胍可以抑制透明细胞肾细胞癌细胞中糖酵解的进行,作用机制可能是由于激活AMPK,下调m TORC1的表达,进一步抑制HIF-1α的作用,使肿瘤细胞的GLUT1的表达含量减少,使细胞吸收的葡萄糖总量减少,抑制了肿瘤细胞的糖酵解过程。2.二甲双胍对透明细胞肾细胞癌细胞的肿瘤生物学行为有负调控作用。二甲双胍可以抑制透明细胞肾细胞癌细胞ki67的表达,抑制细胞增殖;二甲双胍可以抑制透明细胞肾细胞癌细胞的迁移和侵袭,并且改变细胞中Bax/Bcl2的比值,促进细胞凋亡;二甲双胍还会改变透明细胞肾细胞癌细胞的周期分布,使肿瘤细胞的细胞周期停留在G1期不向S期转运。3.二甲双胍可以上调透明细胞肾细胞癌细胞中mi RNA-1291的表达。