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随着体外受精-胚胎移植(Invitro fertilization embryo transplantation, IVF-ET)和冷冻技术的发展,冷冻技术在动物种质资源的保存上得以推广应用,虽然卵母细胞的冷冻方法在不断发展,但是由于冷冻后受到一定的损伤,对其后的发育会产生一定的影响。尤其是卵母细胞在冷冻后,再进行孤雌培养是充分利用卵母细胞的一个重要部分。这对充分利用屠宰场里大量的荷斯坦牛卵母细胞有一定帮助。本研究探讨了冷冻后卵母细胞的成熟与孤雌激活,以及冷冻处理对孤雌激活的影响。本研究分为三个实验,研究结果如下。试验一不同冷冻方法对牛卵母细胞体外成熟及孤雌胚发育的影响1.冷冻后卵母细胞形态正常率、卵裂率、囊胚率与对照组差异极显著(P<0.01),卵裂率及囊胚率小于对照组,说明冷冻处理对卵母细胞有一定的损伤,对卵母细胞后续的激活,培养均有一定的影响。本研究观察到,麦管法与OPS法差异极显著(P<0.01),OPS法冷冻的卵母细胞形态正常率、卵裂率、囊胚率均显著比麦管法冷冻要高,说明OPS法可以有效地保护卵母细胞,保证其后孤雌激活,冷冻程序对卵母细胞造成的影响较小(P>0.05)。2.冷冻后卵母细胞形态正常率、卵裂率、囊胚率与对照组相比,差异极显著(P<0.01)。而保护剂1与保护剂2之间差异不显著,但保护剂2比保护剂1的要高,说明保护剂2对牛卵母细胞的保护能力比保护剂1效果要好,而保护剂1的卵母细胞卵裂率要略高与保护剂2(P>0.05)。3.OPS法平衡温度38℃与25℃相比,差异不显著。在38℃时,卵母细胞形态正常率、卵裂率、囊胚率均略高于25℃。实验结果表明,在38℃与25℃之间平衡温度,对冷冻后卵母细胞孤雌发育的影响不大。本实验证实,38℃、25℃时与4℃相比,差异极显著,当平衡温度明显降低后,会对卵母细胞的孤雌发育造成显著的影响,平衡温度不宜低于25℃。在4℃时,冷冻后的卵母细胞激活后出现囊胚,实验结果表明低温平能温度对孤雌发育的囊胚阶段有较大影响。试验二不同培养条件对牛卵母细胞体外成熟及孤雌胚发育的影响1.在成熟培养液中添加不同浓度卵泡液,发现:添加0%-20%的卵泡液,对卵母细胞孤雌激活后的卵裂率没有明显影响(P>0.05);添加10%,20%的卵泡液卵母细胞孤雌激活后,囊胚发育率(14.6%,14.8%)明显高于添加5%和0%组(10.9%,11.4%,P<0.05),结果表明,在成熟培养液中添加10%,20%卵泡液对卵母细胞的成熟与随后的囊胚发育有促进作用。2.本试验分别用三蒸水和Mill—Q超纯水配制的培养液培养牛孤雌激活胚胎,结果表明,卵母细胞成熟率(PbI排放率)和卵裂率及囊胚率等无显著影响(P>0.05)。水并不是影响孤雌激活胚胎发育的关键因素,只要水质干净,符合培养用水就不会给随后的培养造成较大影响。试验三不同作用时间对牛卵母细胞体外成熟及孤雌胚发育的影响1.试验结果表明,体外成熟24 h—30 h的卵母细胞,激活后卵裂率差异不显著(P>0.05),但随着成熟时间延长,卵裂率有上升趋势。卵母细胞成熟28 h或30h囊胚的发育率为(16.4%,15.3%)明显高于成熟24 h或26 h的囊胚发育率(10.5%,9.8%.P<0.05)。卵母细胞随着成熟时间的延长,卵母细胞得到较为充分的成熟过程,成熟卵母细胞数量就会增多,这可能就是卵母细胞激活后囊胚率提高的另一个因素。2.本实验研究结果证实,牛成熟卵母细胞用离子霉素激活5 min,再用6-DMAP激活2h,卵裂率显著低于激活4h,6h组(P<0.05),6—DMAP作用时间为4h或6h的囊胚发育率明显高作用于2h或8h的囊胚发育率(P<0.05)。结果表明,卵母细胞成熟28h后,用5 um ionomycin培养液激活5 min,然后在含有2mM在6—DMAP的培养液培养4h—6h为宜。激活4h与6—DMAP激活时间6h相比差异不显著。6—DMAP作用时间为8h,囊胚发育率有下降趋势。表明6—DMAP作用时间对牛成熟卵母细胞的激活效率有影响。本试验认为,离子霉素联合6—DMAP激活牛卵母细胞,6—DMAP作用时间以4-6 h为宜。