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通过对分离自一株赭曲霉(AspergillusochraceusFA0611)的dsRNA序列克隆测序,获得了侵染该种真菌dsRNA病毒的核酸序列信息,同时为侵染同种真菌不同分离物(A.ochraceusATCC28706)的复合病毒(Mycoviruscomplex)(AoV)的深入研究提供了重要的分子信息。
从杭州郊区采集的发病蚕豆叶上,分离到一种携带dsRNA病毒的优势真菌FA0611。形态学特征及ITS序列与Betatubulingene序列分析结果表明,FA0611属于赭曲霉(A.ocharceus)。
应用常规方法从A.ocharceusFA0611细胞中抽提dsRNA,获得3条1000~2000bpdsRNA条带,根据dsRNA来源及片段大小,分别将它们命名为AoR1、AoR2和AoR3。自菌丝体提取病毒粒子的SDS-PAGE检测结果表明,存在一条分子量略大于86kDa的蛋白条带。
利用优化的单引物扩增法对3条dsRNA进行克隆,测序结果显示AoR1大小为1754bp,BLASTN和BLASTP分析表明,该序列与Kimetal.(2006)从侵染赭曲霉(A.ochraceusATCC28706)的复合真病毒AoV中的dsRNA1(Accessionno.DQ270031)序列基本一致(核酸序列相似性为94%,氨基酸序列相似性为97%),AoVdsRNA1编码的蛋白与PenicilliumstoloniferumvirusS(PsV-S)的复制酶(RNA-dependentRNApolymerase,RdRp)具有较高的同源性。AoR2大小为1555bp,其正链上所含的最大开放阅读框(Openreadingframe,ORF)编码一个分子量约为47kDa的蛋白。BLASTP分析结果表明,AoR2所编码的蛋白序列与双分体病毒科成员(Partitivirus)的外壳蛋白(Capsidprotein,CP)序列有较高的相似性,其中与PsV-S的CP蛋白相似性为63%。AoR2与AoR1的5’(Untranslatedregion,UTR)高度相似,含有相同的5’末端序列(5’-CGCAAAA-3’)和3’末端序列(5’-CUCC-3’)。AoR3大小为1222bp,其正链上含有的最大ORF,编码33.6kDa的蛋白,BLASTP分析表明,GenBank数据库中GremmeniellaabietinaRNAvirusMS2RNA3编码的蛋白[YP_138542]与其具有31%的相似性,GremmeniellaabietinaRNAvirusMS1RNA3[NP_6590291编码的蚩白与其具有30%的相似性,但是由于这两条蛋白序列的功能至今还是未知,故AoR3的功能也未知;AoR3的UTR与AoR2、AoR1的UTR相似性较低,但在5’末端,AoR3与AoR2、AoR1含相同的保守序列(5’-CGCAAAA-3’)。以上分析表明,AoR2与AoR1分别编码双分体病毒的CP和RdRp,而AoR3的功能未知,可能为病毒的卫星RNA。
根据获得的AoR1、AoR2与AoR3序列设计引物对病毒粒子的核酸进行RT-PCR检测,结果表明:可同时扩增出3条对应于AoR1、AoR2和AoR3的片段。因此,菌丝体中的AoR1、AoR2和AoR3来源于一共同的病毒。
通过Protean软件分别预测AoR2编码的CP和PsV-S的CP次级结构,二者比较显示:AoR2编码的CP与PsV-S的CP次级结构元件组成明显不同。这进一步说明两个CP的区别。
综上所述,根据AoR1、AoR2与AoR3的片段大小和序列比对分析结果以及ICTV对双分体病毒属(Partitivirus)成员的特征描述,这三条序列可能来源于双分体病毒属的一种病毒,与Kim&Bozarth研究的复合真菌病毒AoV不同,我们分离到的是单一病毒组分,考虑到该病毒是目前唯一具有全基因组序列报道的赭曲霉病毒,我们将其命名为A.ochraceusvirus1(AoV1)。AoR1、AoR2与AoR3完整序列的获得为侵染赭曲霉的真菌病毒核酸序列分析提供了必要的条件,同时,CP序列的报道填补了一直以来侵染赭曲霉的真菌病毒CP序列信息的空白。