原发性肝癌(主要为肝细胞癌,以下简称肝癌)是全球发病率和死亡率均较高的恶性肿瘤之一,其发病率居第五位,病死率居第三位。在我国每年新诊断的肝癌约占全世界的55%,其死亡率在我国恶性肿瘤中位列第二位。随着诊断技术及治疗手段的进步,近二十年来疗效已经有了一定的提高,但肝癌的转移复发仍是影响长期疗效的重要阻碍。因此深入研究肝癌转移复发机制、探索有效预测肿瘤复发的分子标志物和积极抗复发治疗措施也是当前肝癌诊治中的重点和难点。核不均一核糖核蛋白家族(Heterogeneous ribonucleoprotein, hnRNPs)是广泛表达的一类RNA结合蛋白,参与mRNA转运、代谢、剪切及表达等过程的调节。HnRNPs家族种类繁多,已经发现有20多种蛋白,依次从A命名到U。HnRNPs的功能近年来在各个领域得到深入的研究,发现其参与了多种疾病的发生发展过程,如病毒性疾病、肿瘤、自身免疫性疾病等。HnRNPs与目前威胁人类生命的肿瘤疾病关系密切,多种肿瘤的形成和发展都与该家族蛋白有关。研究表明hnRNPA1通过促进端粒延长,促进细胞增殖和抑制细胞凋亡等,从而促进肿瘤的发生发展；hnRNPA2/B1已经可以作为肺癌早期诊断的指标,而目前肝癌领域的相关研究还处于起步阶段。复旦大学肝癌研究所(以下简称本所)研究人员运用高通量蛋白组学筛选肝癌转移相关的差异蛋白,发现在转移潜能不同的肝癌细胞中,hnRNPA2/B1、hnRNP H和hnRNP K的表达与肝癌细胞转移潜能正相关；而hnRNP C和L的表达与肝癌细胞转移潜能负相关,表明hnRNPs家族与肝癌发生发展密切相关。我们课题组的前期研究发现hnRNP A/B亚家族作为hnRNPs家族的核心成员在不同转移潜能肝癌细胞系中表达异常。因此,本课题旨在通过分析不同转移潜能人肝癌细胞系及有和无复发肝癌组织标本中hnRNP AB的表达、由323例有完整的临床和随访资料的肝癌组织构建的组织芯片中hnRNP AB表达,研究其与肝癌患者预后的关系；通过构建靶向shRNA慢病毒载体pGCSIL-hnRNP AB并将其转染HCCLM3细胞,同时构建慢病毒超表达载体转染HepG2细胞,通过细胞生物学实验和裸鼠模型实验观察hnRNP AB对肝癌侵袭转移的影响。应用Chip on chip和Chip PCR技术筛选并验证hnRNP AB作为转录因子参与调控的靶基因,同时检测肝癌细胞中hnRNP AB潜在的互作蛋白,深入探讨hnRNPAB促进肝癌侵袭转移的作用机制,为肝癌的基因治疗提供新的靶点。第一部分HnRNP AB在肝癌侵袭转移中的作用目的：观察hnRNPAB在人肝癌细胞株及肝癌患者组织中的表达,初步探讨其与肝癌转移复发的关系。方法：利用qRT-PCR和western blot方法检测肝癌患者组织和具有不同转移潜能的人肝癌细胞株hnRNP AB的表达。构建hnRNPAB过表达及knock-down hnRNP AB细胞株,通过划痕实验和Transwell检测hnRNPAB对肝癌细胞体外迁移及侵袭能力的影响。利用免疫缺陷的裸鼠模型研究hnRNP AB对肝癌细胞体内肺转移的影响。结果：HnRNP AB在肝癌组织广泛表达,其在肝癌组织中表达水平显著高于其对应的癌旁组织；在术后复发病人的肝癌组织中,相比较于未复发的病人组织,hnRNP AB表达水平也显著升高。在肝癌细胞系中,hnRNP AB的表达水平随着肝癌细胞系侵袭转移潜能的增强而显著升高。在低转移潜能肝癌细胞系HepG2中,过表达hnRNP AB后显著提高肝癌细胞在体外的迁移和侵袭能力；在高转移潜能肝癌细胞系HCCLM3中转入shRNA下调hnRNPAB表达后,肝癌细胞在体外的迁移和侵袭能力显著降低。裸鼠体内试验显示：过表达hnRNPAB的肝癌细胞株在裸鼠体内肺转移灶的数目较对照组明显增加,而干扰hnRNPAB表达的肝癌细胞株在裸鼠体内肺转移灶数目显著减少。结论：HnRNPAB在肝癌组织中异常表达,hnRNPAB促进肝癌细胞体外迁移及侵袭,在体内促使肝癌细胞肺转移的能力显著提高,可见hnRNP AB在肝癌细胞的侵袭转移过程中发挥重要作用。第二部分HnRNPAB介导肝癌细胞发生上皮间质转化目的：观察hnRNPAB和上皮间质转化(EMT)主要标志分子在人肝癌细胞株中及肝癌患者组织中的表达,初步探讨hnRNPAB在肝癌发生发展过程中发挥的生物学功能。方法：利用qRT-PCR和western blot方法检测对照组、过表达和knock down hnRNPAB细胞株中EMT主要标志分子的表达。应用组织芯片检测EMT主要标志分子在肝癌组织中的表达谱,分析其与hnRNPAB表达的相关性。在免疫缺陷的裸鼠模型中,利用免疫组织化学检测hnRNPAB对EMT主要标志分子表达的影响。结果：我们发现过表达hnRNPAB后,HepG2细胞发生EMT的改变,形态呈细长梭形,同时E-钙黏蛋白表达显著下降,N-钙黏蛋白和波形蛋白表达显著升高。同时,knock-down hnRNPAB后,HCCLM3细胞中E-钙黏蛋白表达升高,同时N-钙黏蛋白和波形蛋白表达下降。在肝癌组织中,E-钙黏蛋白与hnRNP AB的表达呈负相关,而hnRNP AB与波形蛋白的表达呈正相关。结论：HnRNP AB可能通过介导上皮间质转化(EMT)促进肝癌侵袭和转移。第三部分HnRNP AB通过转录激活snail的表达抑制E-钙黏蛋白目的：研究hnRNPAB介导上皮间质转化(EMT)促进肝癌细胞侵袭与转移的作用机理。方法：利用Chip on chip技术检测筛选hnRNPAB介导肝癌细胞发生EMT参与调控的相关基因,并通过chip-PCR进行验证。在hnRNPAB过表达和干扰细胞株中检测其调控的关键基因的表达水平,通过在hnRNPAB稳转细胞株中干预其靶标基因的表达,检测其对肝癌细胞侵袭能力及EMT过程的影响。利用qRT-PCR和western blot方法检测肝癌组织中hnRNPAB关键靶基因表达水平,分析其与hnRNP AB表达的相关性。结果：通过Chip on chip和chip-PCR,我们初步筛选和验证转录因子snail是hnRNP AB在介导肝癌细胞EMT过程中调控的关键靶基因。过表达hnRNPAB后,HepG2细胞中的snail表达水平显著升高,E-钙粘蛋白水平显著下降,肝癌细胞呈现EMT形态改变。HepG2-hnRNPAB细胞株中共转入shRNA-snail干扰质粒后,在过表达hnRNPAB导致的细胞形态变化消失,同时hnRNPAB过表达所致的肝癌细胞侵袭能力提高得到明显抑制。相反,在HCCLM3中knock-down hnRNPAB后,snail表达水平显著降低；共转入snail-cDNA质粒后,snail表达水平上升至对照细胞的水平,同时hnRNP AB干扰造成的肝癌细胞侵袭能力减弱得到明显提高。裸鼠模型的瘤组织中,免疫组织化学结果表明hnRNP AB上调后通过促进snail表达而抑制E-钙黏蛋白表达。同时我们发现肝癌组织的hnRNP AB和：snail表达水平具有显著正相关性。结论：HnRNPAB通过转录激活snail表达抑制E-钙黏蛋白介导EMT,促进肝癌侵袭和转移。第四部分HnRNPAB在肝癌患者预后的预测价值目的：初步研究hnRNPAB在肝癌细胞系中的互作蛋白,并深入探讨hnRNP AB的表达与肝癌患者临床病理特征之间的关系及预测术后复发转移的价值。方法：应用hnRNPAB抗体从肝癌细胞株HCCLM3中富集hnRNPAB的结合蛋白,通过质谱分析与多肽比对初步确定hnRNP AB的结合蛋白肽段,通过免疫共沉淀后western blot验证两者的相互作用,并检测两者的相互作用对snail表达的影响。利用免疫组化方法检测323例肝细胞肝癌组织构建的组织芯片中hnRNPAB和互作蛋白Kap1的表达,分析其与患者临床病理特征及预后的关系。结果：免疫共沉淀联合质谱技术鉴定出Kap1是hnRNPAB在肝癌细胞中的结合蛋白之一,我们进一步通过免疫共沉淀后western blot验证了两者之间的确存在相互作用。HnRNP AB稳转细胞株中,Kap1表达没有显著变化。在干扰Kap1的细胞株中,snail表达下调；在肝癌细胞中同时干扰hnRNPAB和Kap1,snail表达下调最为显著。生存分析表明hnRNPAB高表达组病人术后5年总体生存率显著低于hnRNPAB低表达组病人(p<0.001),其累计复发率显著高于hnRNPAB低表达组病人(p=0.001)。同样Kap1高表达组病人术后预后差,5年总体生存率较Kap1低表达组病人显著降低(p=0.001),而累计复发率显著较Kap1低表达组病人显著升高(p=0.001)。统计分析表明单独的hnRNP AB、Kap1以及两者联合均是肝癌患者术后生存和复发的独立预后影响因素(p<0.001),联合hnRNPAB和Kap1对术后生存和复发的预测价值高于单个指标(p<0.001)。结论：在肝癌细胞中hnRNPAB可能与Kap1形成蛋白复合体共同参与调控snail的表达。HnRNPAB和Kap1均是肝癌术后生存复发的独立预后影响因素,但hnRNPAB联合Kap1是一个更好的独立预后指标,更能准确预测术后的生存和复发。