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现代养猪生产管理程序的许多事件可能成为动物的应激源,如高饲养密度、恶劣的饲养环境、长时间运输、人与动物之间粗暴或激烈的交互模式、热应激等。应激时机体激活下丘脑-垂体-肾上腺（Hypothalamic pituitary adrenal,HPA）轴。HPA轴的主要中枢调节因子是促肾上腺皮质激素释放激素（Corticotropin releasing hormone,CRH）,其作用于垂体前叶促进促肾上腺皮质激素（Adrenocorticotropic hormone,ACTH）分泌,随后ACTH作用于肾上腺皮质促进肾上腺合成并释放糖皮质激素（Glucocorticoid,GC s）。HPA轴又介导下丘脑-肾上腺-性腺（Hypothalamic pituitary gonadal,HPG）轴的功能,HPG轴负责生殖器官的成熟和生物体的生殖能力。CRH抑制促性腺激素释放激素（Gonadotropin releasing hormone,Gn RH）分泌,GCs则抑制促黄体激素（Luteinizing hormone,LH）和卵巢中雌二醇（Estrogen,E2）、孕酮（Progesterone,P）的产生,使靶组织或器官对E2产生抗性。HPA轴激素从不同水平对雌性生殖产生多层次的不利影响。有研究报道,热应激会抑制猪的早期胚胎着床,损伤着床前胚胎发育。母猪在受精后的前15天比此后15-30天对热应激更敏感。母猪妊娠早期阶段,排卵后48 h内禁食应激或间隔6 h反复注射ACTH,胚胎卵裂率及囊胚发育率显著减低,血清中糖皮质激素的皮质醇（Cortisol,CORT）浓度显著升高。在猪上,热应激显著降低了正常卵细胞受精比例。研究表明,受精阶段及胚胎着床前阶段是妊娠期对应激较为敏感的阶段。然而HPA轴激素CRH、ACTH和CORT对猪着床前胚胎发育的影响尚不明确,它们对猪胚胎的损伤是直接还是间接机制尚不清楚。在卵细胞受精及胚胎着床前发育过程中,精子,卵细胞或胚胎处于游离在输卵管中的状态,与母体没有建立直接的血液联系,加之复杂的输卵管腔环境,因此,难以利用某一特定体内应激模型研究具体的HPA轴激素影响猪卵细胞受精及着床前胚胎发育的机制。该试验利用体外模型,研究HPA轴激素影与输卵管上皮细胞（Oviductal epithelia cells,OECs）及卵细胞和着床前胚胎发育之间的作用关系。体外培养的猪着床前孤雌胚胎发育过程直接添加1×10-7 M,1×10-6 M,1×10-5 M CRH或1×10-10 M,1×10-9 M,1×10-8 M ACTH或1×10-7 M,1×10-6 M,1×10-5 M CORT,观察三种激素不同浓度对胚胎发育的影响;当CRH,ACTH或CORT存在时,孤雌胚胎与体外培养的猪原代OE Cs共培养观察胚胎发育的影响;利用CRH,ACTH或CORT预处理OECs制备的条件化体外受精液（Conditional mediu-modified Tris-based medium,CM-m TBM）或胚胎培养液（Conditional medium-pig zygotes medium,CM-PZM）进行卵细胞体外受精或猪着床前胚胎发育并观察受精和胚胎发育情况;OECs体外培养中添加不同浓度CRH,ACT H或CORT观察细胞凋亡情况;结果表明:（1）体外培养猪着床前孤雌胚胎过程中直接添加1×10-7 M,1×10-6 M,1×10-5 M CRH或1×10-10 M,1×10-9 M,1×10-8 M ACTH或1×10-7 M,1×10-6 M,1×10-5 M CORT对猪着床前孤雌胚胎囊胚率和囊胚细胞数无影响（P＞0.05）;（2）体外培养猪原代OECs细胞单层并分别添加1×10-7 M,1×10-6 M,1×10-5 M CRH或1×10-10 M,1×10-9 M,1×10-8 M ACTH或1×10-7 M,1×10-6 M,1×10-5 M CORT,利用Hoechst 33342细胞核染色方法发现当CRH为高于生理浓度的2×10-6 M或CORT为高于生理浓度的10-6 M时可引起OECs细胞发生凋亡（P＜0.05）;流式细胞仪进一步检测添加2×10-6 M CRH或1×10-6 M CORT培养的OECs,结果发现早期及晚期凋亡细胞比例对比不添加激素组都显著升高（P＜0.05）,而添加高于生理浓度的1×10-8 M A CTH培养的OECs早期及晚期细胞凋亡比例无显著升高（P＞0.05）;Western Blot方法检测添加2×10-6 M CRH或1×10-6 M CORT培养的OECs中凋亡效应分子activated Caspase-3蛋白表达量显著升高（P＜0.05）;（3）当2×10-6 M CRH或1×10-6 M CO RT存在时,猪着床前孤雌胚胎与原代OECs单层共培养,结果发现对比不添加激素组胚胎发育的囊胚率显著降低（P＜0.05）,囊胚细胞数显著减少（P＜0.05）;当2×10-6 M CRH或1×10-6 M CORT预处理制备的CM-m TBM或CM-PZM进行体外受精和胚胎培养,结果发现激素组卵细胞多精受精率显著升高（P＜0.05）,胚胎囊胚率较对照组显著降低（P＜0.05）和囊胚细胞数较对照组显著减少（P＜0.05）;（4）添加激素CRH或CORT组CM培养的胚胎囊胚通过RT-q PCR方法检测凋亡分子Bcl-2/Bax的m RNA相对表达量,结果发现对比对照组,激素组CM培养的囊胚中Bcl-2/Bax的m R NA比例显著降低（P＜0.05）;免疫荧光染色方法对囊胚上activated Caspase-3进行染色分析,结果表明,激素组囊胚activated Caspase-3表达量对比对照组显著提高（P＜0.05）;（5）RT-q PCR方法检测添加2×10-6 M CRH或1×10-6 M CORT培养的OECs中生长因子BDNF,IGF1,TGF-β1和OVGP1 m RNA相对表达量,结果发现,激素添加组OECs中4种生长因子m RNA相对表达量较无激素对照组显著降低（P＜0.05）（6）ELISA方法检测添加2×10-6 M CRH或1×10-6 M CORT培养的OECs培养上清中凋亡配体Fas L或TNF-α的浓度,结果表明,激素添加组对比无激素对照组的OECs上清中可溶性Fas L或TNF-α浓度显著提高（P＜0.05）;（7）Western Blot方法检测添加2×10-6 M CRH或1×10-6 M CORT培养的OECs中凋亡受体Fas或TNFR的表达量,结果表明,添加CRH或CORT激素组对比无激素对照组OECs中Fas或TNFR表达量显著升高（P＜0.05）;Western Blot方法检测添加2×10-6 M CRH组OECs中CRHR表达量对比无激素对照组显著升高;添加1×10-6 M CORT培养OECs中GR表达量对比无激素组OECs显著降低（P＜0.05）;（8）脂质体转染Fas L或TNF-αsi RNA的方法敲低OECs中凋亡配体Fas L或TNF-α,然后再添加2×10-6 M CRH或1×10-6 M CO RT进行OECs培养,流式细胞仪检测细胞凋亡水平,结果发现,分别转染Fas L或TNF-αsi RNA组对比转染随机si RNA组OECs细胞早期及晚期凋亡率都显著降低（P＜0.05）（9）免疫荧光染色方法对猪着床前孤雌胚2-细胞期,4-细胞期和囊胚期Fas,TNF R,CRHR和GR进行染色,结果发现,各时期都表达Fas,TNFR和GR,并且Fas和TNFR主要定位于细胞质膜上,而GR主要定位于胞质中。2-细胞期,4-细胞期不表达C RHR,而只在囊胚期细胞质膜上少量表达;（10）RT-q PCR方法分别检测OECs或2.4-细胞期孤雌胚胎中11β-HSD1和11β-HSD2的相对表达量,结果发现,在OECs中11β-HSD1相对表达量是11β-HSD2的561倍,而胚胎中11β-HSD2相对表达量是11β-HSD2的43倍（P＜0.05）。本研究表明,虽然ACTH对猪胚胎发育没有影响,但CRH和皮质醇通过诱导输卵管上皮细胞凋亡间接损害着床前胚胎发育并增加多精现象。因此,CRH或皮质醇处理O ECs后,GR的表达水平下降,CRHR、Fas、TNFR的表达水平明显升高,导致细胞凋亡。凋亡的OECs产生较多的Fas L和TNF-α,而生长因子和OVGP1的表达较少。Fas L和TNF-α分别与胚胎上的Fas和TNFR相互作用,再加上生长因子显著减少,引发了胚胎的凋亡。OVGP1和生长因子的减少增加了多精受精率。细胞凋亡和多精现象均导致了胚胎发育潜能的降低。猪着床前胚胎不表达CRHR而表达CRH-BP,对CRH不敏感;11β-HSD2的表达量高于11β-HSD1,11β-HSD2可将皮质醇转化为无活性的可的松,因而皮质醇对其没有损伤。这些数据对于我们了解不良损伤影响生殖的机制以及采取措施改善不良损伤对受精和胚胎发育的有害影响具有重要意义。