研究背景毛发中的毛囊结构是一个非常有意义的亚器官,不仅它的缺失会给病人带来很大的痛苦,而且自身也呈周期性,有规律地自我再生,在人体内终生不断,是成人有此特征的唯一器官。它对研究上皮与中胚层起源细胞之间的相互作用,器官和组织再生,色素形成,伤口愈合及皮肽癌的发病机制等重要生命过程来说都是极好的模型。毛囊毛发的再生研究不但将给需要毛发移植的患者带来福音,更将对组织工程和细胞再生领域产生极大的影响。毛发移植从1822年Dom Unger的动物实验开始至今,已经经历了近两个世纪。1957年,这项技术由美国学者Orentreich提出毛发供区理论后开始逐渐成熟,1995年美国的limmer教授提出了毛囊单位移植概念,使得移植后的毛发外观更趋自然美观,在临床上得到了广泛应用。毛发移植的过程,包括移植物的制备,受区麻醉,受区的准备及植入几个阶段,由于毛发的供区范围有限,密度较大及该区毛囊单位特殊性的限制,切割毛囊的困难较大,虽经历了近半个世纪的发展,但在制备毛发移植外科方面仍有较大的进步和发展。毛发移植中毛发的供区有限以及手术过程中毛囊单位的损失率较高,限制了毛发移植的广泛应用,成了现代毛发移植外科进步的瓶颈,同时手术时间也比较长,在一定程度上影响了手术效果。最早人们是利用游离的毛囊细胞重建毛囊而获得成功。Rogers等将从新生小鼠上游离下来的毛囊,不培养或进行培养后与真皮成纤维细胞混合移植于裸鼠背部,2～3周后发现裸鼠背部长出了浓密的毛发。Weinberg等在此基础上进一步对毛发生长时所需的细胞成分进行了研究,他们发现新鲜的真皮细胞能诱导毛囊芽悬液重建毛囊,毛囊芽单独移植或与培养过的真皮细胞联合移植虽能构建出皮肤,但不能产生毛发。而游离的成熟毛囊可以在移植部位产生毛发,不需要另外的真皮成分。在实验中他们还发现经过培养后的大鼠触须毛乳头细胞仍具有诱导毛发形成的能力。因此认为成熟毛囊本身即含有毛囊形成所需的成分,而培养过的真皮细胞不能诱导毛囊芽产生毛发可能是因为其缺乏毛乳头细胞所致。Jahoda等对毛囊形成的诱导机制进行了研究,他们认为胚胎期毛囊的形成是真皮和表皮相互作用所致,出生后真表皮细胞之间相互作用也能诱导毛囊的形成,二者具有相似的机制。研究目的1.对毛囊细胞进行分离,培养并传代,确定能诱导出毛囊的种类和以及证实其诱导出新的毛囊并长出毛发的可行性。2.找出一种理想的支架或合成方法,实现毛囊重建,并进行异体或异种毛发移植实验。3.最终目的是在实验毛囊重建,移植在裸鼠身上的实验的同时,实验各种移植方法,探索出一种效率较高效果较好的实验方法,为临床上找到一种既高效效果又好的治疗秃发的方法打下坚实的基础。研究方法1.鼠毛囊细胞组织混合物的制作。将c57的乳鼠剥去皮肤剪碎,用2%胶原酶37℃消化4-6小时,吹打后加D－hank’s液离心,500r/min1min,取上清液保留,剩下的沉淀物在胰酶中37℃消化20-30min,,再加入D-Hank’s液吹打离心500r/min1min,将所取的上清液合在一起,再离心1000r/min10min,倒掉上清液留取沉淀物,然后再重复离心3次后,加入0.5mlD-Hank’s液。2.人毛囊细胞组织混合物的制作。将头皮标本用自来水冲洗并剔净头发,16.29mol/L(75%)乙醇擦拭2遍,以无菌D’Hanks液用消毒牙刷反复刷洗标本3-5遍(每遍均换用无菌器皿);剪除标本边缘部分。以下步骤均在无菌条件下进行。(1)刷净标本置于简易手术台上,用剪刀剥离筋膜。(2)将标本剪成0.3-0.5cm宽,3-4cm长的皮条,再将皮条从真皮-皮下脂肪层交界处剪开。(3)将脂肪层组织置于0.5%分离酶中,4℃过夜(约8-10h);然后再于37℃消化30min,以D’Hanks液将组织漂洗2次,镊子挤出残留的毛干,弃之。(4)将脂肪组织剪成米粒样大小,以0.2%胶原酶D于37℃消化4-6h,直到脂肪组织消化成液体状。(5)消化液中加入等量D’Hanks液后移入离心管离心(2000r/min×5min),弃上清液,沉淀即为毛乳头,毛发,纤维组织,其他细胞成分的混合物。(6)将沉淀物移入平皿中用D’Hanks液反复漂洗,将其中网络的大量毛乳头及其他细胞成分洗下,毛发及纤维组织弃之。(7)将人毛囊细胞混合物移入离心管离心,1000r/min,5min共3-4次,弃上清液,目的在于去除残留的胶原酶。3.大鼠触须毛乳头细胞分离、培养。采用全毛囊消化法和显微解剖法分离触须毛乳头细胞,观察其在体外培养的形态学和生物学特点。大鼠麻醉后修剪颊侧被毛,常规消毒后剪去全层皮肤,暴露其下方的触须毛囊,然后用镊子将其完整拔出,置离心管中,在37℃缓慢搅拌的条件下加入0.2%胶原酶Ⅰ消化3小时,间断吹打使毛乳头游离,静置使毛干沉入管底,吸出上清,经400目筛网过滤后收集截留的毛乳头。显微解剖法参照文献中的操作进行。4.鼠毛囊细胞组织混合物+胶原凝胶移植。如上所述,分别获得鼠毛囊组织混合物,然后将这些组织混合物加上胶原凝胶,加入DMEM培养液,放在温箱早培养12h或18h后,将混合物一起移植到裸鼠上培养。5.毛囊重建的方法。裸鼠皮下注射分离的毛囊复合组织群,分别在14d、30d、60天后进行组织切片。研究结果1.采用鼠毛囊细胞组织混合物来移植,缩短了实验操作的时间和降低了实验操作的难度,得到了毛囊样结构。2.采用人毛囊细胞组织混合物来移植,从另一方面得到了毛囊样结构。3.实验采用凝胶结合毛囊细胞组织混合物的方法来移植,同样得到了毛囊样结构。4.采用DPE细胞结合毛囊细胞组织混合物的方法来移植,又得到了毛囊样结构,从切片效果来看,要好于单纯的毛囊细胞组织混合物。研究结论1、在鼠毛囊细胞组织混合物的探索中,关于毛囊再生,涉及到了毛囊的上皮与间质之间的相互作用,这项研究强调了在毛囊传代和表皮角质化细胞分化潜力中,上皮和间质相互作用的重要性,并对一种新的毛囊重建模型进行了初步的探索。2、在人毛囊细胞组织混合物的探索中,双向的上皮和间质相互作用的高度协调性对于毛囊的形态发生是必须的,毛发重建模型已经建立起来。然而不像以鼠类细胞为基础的毛发重建那样,目前为止来自于人细胞准备的毛发重建还没有被报道,这次实验是对毛发重建的一次有力的探索。3、在支架移植方面,同样得到了毛囊样结构。从另一方面,再次体现了此模型具有多样性。同时也表明了支架材料在毛囊重建方面大有可为。不过从效果来看,此次毛囊样结构比起鼠或人毛囊细胞组织混合物得到的结构来说,都显得差一些。这也提示我们需进一步加强上皮与间质相互作用的前提下,合理使用支架材料,从另一个方面对毛囊重建的应用进行了探索。4、在混合有DPE细胞的实验中,我们得到了实验以来最好的实验结果。得到了比较完整的毛囊样结构,而且数量也较多。所以从长远考虑,单纯的毛乳头细胞或单纯的上皮细胞移植,都很难得到毛发。如果继续从种子细胞和实验方法进行改进,实验其他的细胞,或在实验中对混合物进行一定的纯化,都将对实验效果起到很好的作用。