研究背景和目的糖尿病肾脏病(diabetic kidney disease, DKD)是糖尿病患者常见的慢性微血管并发症,其发病率随着糖尿病的快速增长而逐年上升,已成为终末期肾病的主要原因,DKD的防治也成为内分泌科和肾脏科医师面临的难题之一。然而该病的发病机制迄今尚未完全阐明,既往认为DKD的早期病变部位主要在肾小球,近年来的研究发现肾小管病变无论从发病时间或发病机制看均有其独立性,并且肾小管病变及肾间质纤维化的程度与肾功能的相关性比肾小球硬化与肾功能的相关性更为密切,故肾小管间质纤维化的发生机制越来越受到人们重视。肾间质纤维化是DKD的重要的病理特征,表现为细胞外基质(ECM)的沉积,主要包括胶原和纤连蛋白沉积。肌成纤维细胞是产生ECM的重要来源。肾小管上皮细胞在病理条件下失去上皮细胞的特性而获得肌成纤维细胞的特性,转化为间质肌成纤维细胞的过程称为上皮间质转化(EMT)。研究表明肾小管上皮细胞转分化是肌成纤维细胞的重要来源,且在糖尿病肾脏病的发生和发展中起重要的作用。阻止EMT可能是延缓小管间质损伤进展的主要措施。因此进一步寻求阻断肾小管上皮细胞损伤及肾间质纤维化作用的手段,将是今后研究防止DKD持续进展和保护肾功能的重要目标。微小RNA(miRNA)是长约22个碱基的短链非编码RNA,它通过与靶基因的3’非翻译区(3’UTR)结合,使靶基因沉默或者降解,起到转录后调节靶基因的表达的作用。目前已经发现了超过2000种人类的miRNA,以及超过60%的人类蛋白编码基因接受miRNA的调控。因此miRNA靶向调控大量的基因,从而参与了众多疾病发生和发展的过程。近年来的研究表明,miR-26和miR-30家族在多器官组织的纤维化、凋亡等病理生理进程中发挥重要的作用。在特发性肺纤维化细胞模型中,miR-26a通过抑制靶基因Lin28B进而调控let-7d的表达,从而抑制肺纤维化。NF-κB调控miR-26a的表达,而miR-26a进一步靶向调控Col-Ⅰ和CTGF,从而缓解心肌纤维化。在猪肾血管疾病模型中,通过原位杂交技术发现miR-26a主要表达在肾小管细胞中,且在肾血管疾病模型中表达显著降低,同时抑制miR-26a则可诱导肾小管上皮细胞凋亡和调节促凋亡蛋白表达。miR-133和miR-30c均通过抑制靶基因CTGF从而缓解了心肌纤维化。miR-30通过靶作用于Notch1和p53从而抑制足细胞损伤。但是在糖尿病肾脏病肾纤维化,尤其是在肾小管上皮细胞EMT进程中,miR-26a和miR-30c的研究较少,因此本研究旨在探索miR-26a和miR-30c在糖尿病肾脏病肾小管上皮细胞EMT中的作用以及具体机制。最近研究表明miRNA不但可以调控多个基因,多个miRNA也可以同时调控一个基因的表达,形成一张复杂的调控网络,从而更加精确地对机体进行调控。然而,目前在miRNA领域,大多数研究探索单一miRNA对单一靶点的影响,近年来,多个miRNA协同靶作用于一个基因和单一niRNA同时调控多个靶点正在成为热点,比如在乳腺癌中,miR-143和miR-145协同调控靶基因ERBB3从而抑制细胞增殖和侵袭。此外,miR-455同时靶作用于Necdin、 Runxltl和HIF1an三个转录因子,从而调控棕色脂肪细胞的分化。目前在DKD领域,探索多个miRNA协同参与糖尿病肾脏病的研究较少。本研究致力于探索miR-26a和miR-30c是否能分别调控糖尿病肾脏病的进展,同时探索miR-26a和miR-30c是否具有协同作用。首先,我们使用TGFβ1 (10ng/ml)刺激肾小管上皮细胞(NRK-52E),比较miR-26a与miR-30c以及纤维化相关基因的表达,同时我们检测了40周龄OLETF大鼠皮质中niR-26a与miR-30c的表达,进一步在体内验证miR-26a、miR-30c与DKD的关系；通过生物信息学方法,我们预测miR-26a和miR-30c均靶作用于CTGF,同时预测Snail1为miR-30c的靶基因,并且进行荧光素酶报告基因实验证明假设；接下来我们在NRK-52E细胞中分别和同时过表达或敲除miR-26a与miR-30c,探索miR-26a与miR-3Oc是否协同作用于肾小管上皮细胞EMT。机制部分,我们进一步探索miR-26a与miR-30c是否同时调控ERK1/2和p38 MAPK信号通路,并同时敲除miR-26a与niR-30c的靶基因CTGF和Snail1,观察是否这两个转录因子存在协同调控EMT的作用。方法1.细胞培养将冻存的大鼠肾小管上皮细胞株(NRK-52E)置于37℃中水浴锅中复苏,培养于DMEM高糖培养基中(含10% FBS),并在37℃、5%C02培养箱中孵育。每2-3天更换新的培养基。2.细胞转染(1)miRNA的mimic和inhibitor转染转染前一天,细胞接种于12孔板中,每孔铺约3*104个细胞。第二天采用lipo3000进行瞬时转染(操作按lipo3000转染试剂说明书进行)。miRNA的mimic转染浓度为50nM, miRNA的inhibitor转染浓度为150nM,共转染2种miRNA的]mimic/inhibitor时,则每种mimic/inhibitor用量减半,保证每组miRNA的mimic/inhibitor用量相等。(2) siRNA瞬时转染转染前一天,细胞接种于12孔板中,转染时每孔铺约3*104个细胞。第二天采用lipo3000进行瞬时转染(操作按lipo3000转染试剂说明书进行)。siRNA转染浓度为50nM。共转染2种siRNA时,则每种siRNA用量减半,保证每组siRNA用量相等。(3)质粒和mimic共转转染前一天,细胞接种于24孔板中,转染时每孔铺约1.5*104。第二天采用lipo3000进行瞬时转染(操作按lipo3000转染试剂说明书进行)。24孔板中mimic的转染量为50nM,荧光素酶报告基因质粒转染量为1μg,内参β-gal质粒转染量均为0.2μg。共转染2种miRNA的mimic时,则每种mimic用量减半,保证每组niRNA的mimic用量相等。3.RNA提取、逆转录和实时荧光定量PCR (qRT-PCR)Trizol法提取细胞组织总RNA,使用分光光度计定量核酸。使用M-MLV逆转录酶试剂将RNA逆转录为cDNA。使用SYBR法进行实时荧光定量PCR反应。基因表达量按2-△△Ct方法计算得出。β-actin作为内参基因。4. Western blot使用RIPA法提取组织或细胞总蛋白,BCA法测定样品蛋白浓度,100-C水变性蛋白。配制8%-15%的SDS-PAGE胶,电泳分离样品蛋白,湿转目的蛋白到PVDF膜上。用含5%脱脂奶粉或者5%BSA的TBST封闭PVDF膜,将目的蛋白的一抗稀释后与PVDF膜在4-C摇床上孵育过夜。第二天,PVDF膜置于TBST洗涤,再与荧光二抗(1：15000)避光孵育1h,再次置于TBST洗涤后,在Odyssey近红外成像系统进行发光显影,并用凝胶图像分析系统(Quantity One)分析结果。5.动物实验实验使用40周龄自发性2型糖尿病大鼠(OLETF鼠,n=3)和同系野生型非糖尿病大鼠(LETO鼠,n=3)肾组织。大鼠由日本大冢制药株式会社德岛研究所提供,在无特定病原体(SPF)条件下单笼标准饲料喂养。肾脏冻存于液氮中保存。6.肾组织病理学收集液氮中冻存的肾组织,用4%多聚甲醛固定24h,石蜡包埋、切片。Masson染色法用于观察肾组织的形态结构；免疫组织化学法用于分析CTGF和Snail 1的表达情况。肾组织切片被兔抗CTGF多克隆抗体以1：100或兔抗Snail 1多克隆抗体以1：100孵育,再用辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)标记的二抗孵育,最后苏木素复染。正置显微镜观察所有染色切片。7.荧光素酶报告基因实验构建野生型CTGF和Snail 1的3’UTR区载体,使用快速点突变试剂盒突变与3’UTR区位点结合的miRNA的种子序列区。按照碧云天荧光素酶试剂盒说明书在多功能酶标仪上测定RLU值以及检测p-半乳糖苷酶的吸光度。8.统计分析采用SPSS21.0统计软件进行处理,各指标数据采用均数±标准误(X±SEM)表示。多组均数比较采用单向方差分析(One-way ANOVA),多重比较采用LSD法(Least-significant difference test);方差不齐时,用Welch法校正,多重比较采用Dunnett’s T3法。正态分布两两比较采用两独立样本t检验。非正态分布采用Mann-Whitney U检验。P<0.05时被认为差异具有统计学意义。结果1. miR-26a和niR-30c在TGFβ1诱导的NRK-52E细胞和OLETF大鼠肾皮质中的变化10ng/mLTGFβ1刺激NRK-52E细胞72h, Western Blot和qRT-PCR检测均发现：与Control组相比,TGFβ1组中FN、Col-Ⅰ、α-SMA、CTGF和Snail 1表达均显著升高,E-cadherin表达显著下降。同时,qRT-PCR法检测发现：与Control组相比,TGFβ1组中miR-26a和miR-30c表达均显著下降。这表明miR-26a和miR-30c均可能参与到DKD的进程。取我们实验室既往保存于液氮中的40周龄的LETO和OLETF大鼠肾脏皮质,通过masson染色证实40周龄的OLETF大鼠肾脏出现明显的肾间质纤维化。免疫组化和western blot结果均显示,与LETO非糖尿病大鼠相比,OLETF大鼠肾皮质CTGF和Snail 1蛋白表达明显升高。通过qRT-PCR检测发现,与LETO非糖尿病大鼠相比,OLETF大鼠肾皮质的miR-26a和miR-30c的表达均显著下调。这进一步表明,miR-26a和]miR-30c可能参与DKD的发病进程。2. miR-26a和miR-30c通过靶基因CTGF和Snail 1协同调控TGFβ1诱导的EMT1)靶基因鉴定a) Targetscan生物信息学软件预测CTGF基因3’UTR区中含有miR-26a和miR-30c的结合位点,而Snail 1基因3’UTR区中也含有miR-30c的结合位点。荧光素酶报告基因实验证实了miR-26a和miR-30c均靶作用于CTGF且具有协同作用,而miR-30c靶作用于Snail1。b) Western blot和qRT-PCR检测均证明转染miR-26a或miR-30c的mimic下调CTGF的表达,共转染miR-26a和miR-30c的mmic具有协同下调CTGF的作用；而转染miR-30c的mimic下调Snail 1的表达。2) miR-26a和miR-30c协同调控NRK-52E细胞EMTa) Western Blot和qRT-PCR检测均证明：在存在TGFβ1的情况下,转染miR-26a或niR-30c的mimic均下调FN、Col-Ⅰ和α-SMA,上调E-cadherin;共转染miR-26a和miR-30c的mimic则协同下调FN、Col-Ⅰ和α-SMA,并且协同上调E-cadherin。b)在存在TGFβ1的情况下,转染miR-26a或miR-30c的inhibitor上调FN、 Col-Ⅰ、α-SMA,同时下调E-cadherin。共转染niR-26a和miR-30c的inhibitor协同上调FN、Col-Ⅰ、α-SMA,同时协同下调E-cadherin。3. miR-26a和miR-30c协同调控TGFβ1诱导的EMT的机制探讨1)我们进一步探讨miR-26a和niR-30c协同调控NRK-52E细胞EMT的具体机制,既往的研究表明,CTGF调控下游的ERK1/2和p38 MAPK信号通路,因此我们进一步探索miR-26a和miR-30c是否协同调控ERK1/2和p38MAPK信号通路。结果表明：miR-26a和miR-30c协同抑制ERK1/2和p38 MAPK蛋白的磷酸化。这说明miR-26a和miR-30c可能通过协同抑制CTGF进而调控ERK1/2和p38 MAPK信号通路。2) miR-26a和miR-30c也可能通过CTGF和Snail1这两个转录因子进而起到协同作用。我们进一步探索CTGF和Snail 1这两个转录因子是否具有相互作用。在TGFβ1存在和不存在的情况,转染siCTGF对Snail1无明显的影响,转染siSnail1对CTGF也无明显的影响,这说明CTGF与Snail1为互相独立的转录因子。同时我们探索CTGF和Snail1转录因子是否协同调控NRK-52E细胞EMT。与对照组相比,分别转染CTGF或者Snail1的siRNA于NRK-52E细胞显著缓解TGFβ1诱导EMT。但是共转染CTGF和Snail1的siRNA于NRK-52E细胞并没有观察到明显的协同抑制EMT的效应。结论1、miR-26a和miR-30c在TGFβ1诱导的NRK-52E细胞以及在40周龄的OLETF大鼠肾脏皮质中表达明显下调；2、荧光素酶报告基因实验证实miR-26a和miR-30c协同靶作用于与CTGF, miR-30c靶作用于Snail1;过表达miR-26a或niR-30c分别下调CTGF表达,同时过表达niR-26a和miR-30c则协同下调CTGF表达。过表达miR-30c下调Snail1表达；3、与单独转染miR-26a和miR-30c的mimic (inhibitor)相比,共转染miR-26a和miR-30c的nimic (inhibitor)协同抑制(增强)TGFβ1诱导的EMT；4、共转染miR-26a和miR-30c的mimic协同抑制TGFβ1诱导的ERK1/2和p38 MAPK信号通路的激活；5、CTGF和Snail1为相互独立的转录因子；分别抑制CTGF或Snail1均可抑制TGFβ1诱导的EMT,但是同时抑制CTGF和Snail 1未观察到明显的协同作用。