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研究背景和目的:胃癌是我国最常见的消化道恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率分别占所有恶性肿瘤的第2位和第3位,晚期比例高达80%,5年生存率不足10%。胃癌腹膜转移及其合并的恶性腹水是胃癌患者的主要死因之一。目前胃癌腹膜转移的确切机制尚未完全阐明,临床治疗效果较差。胃癌恶性腹水缺乏有效的研究模型,制约了相关研究的进展。肿瘤类器官是一种新型体外3D模型,能极大程度保留原肿瘤细胞的特征。目前,许多常见肿瘤来源的肿瘤类器官均已成功构建,并且有报道用于临床药敏试验。但目前尚未有培养恶性腹水来源肿瘤类器官的报道。在这里我们用胃癌患者的恶性腹水构建肿瘤类器官模型,并通过病理组织学和基因组学等方法进行鉴定。针对腹水上清能促进肿瘤类器官生长的现象,我们从外泌体以及细胞信号转导通路变化等角度进行了初步研究,以期进一步深入探讨胃癌腹膜转移的分子生物学机制。研究方法:1、收集胃癌患者腹水用于类器官培养。肿瘤类器官培养的主要步骤:离心分离腹水上清和细胞沉淀,显微镜下细胞计数,每400个细胞团/1000-2000个单细胞用50μl Matrigel重悬,混匀后接种于预热24孔板。将24孔板置于37℃培养箱,待Matrigel凝固后,加入500μl腹水上清-类器官培养基混合液。肿瘤类器官在37℃、5%CO2培养箱中培养,每3天更换一次培养基。2、培养成功后,进行鉴定:(1)病理形态学鉴定:H&E染色和免疫组织化学染色;(2)基因组学:全外显子组基因测序。3、超速离心法提取胃癌腹水上清中的外泌体,并用Western Blot与透射电镜进行鉴定。将外泌体用于类器官的培养,观察比较与对照组、腹水上清组和去外泌体腹水上清组的差异。用免疫荧光染色和Western Blot检测非磷酸化β-catenin的表达。4、Real-time PCR检测对照组与腹水上清处理组STAT3的转录水平,Western Blot检测STAT3的表达水平与磷酸化水平和β-catenin的表达水平。磷酸化STAT3抑制剂Stattic处理腹水上清处理组SNU16细胞后进行流式细胞周期检测分析,并用Western Blot检测STAT3磷酸化抑制程度。结果:1、共收集36例胃腺癌患者腹水,49株胃癌腹水来源的肿瘤类器官成功建立(其中2例患者腹水进行3次取样,9例患者进行2次取样),成功率达95%。病理形态和基因突变谱均与腹水肿瘤细胞显示出高度一致性。2、外泌体对肿瘤类器官生长速度无明显影响,但去外泌体腹水上清促类器官生长效应与腹水上清近似。免疫荧光染色和Western Blot结果显示,腹水上清与去外泌体腹水上清均能增加非磷酸化β-catenin在细胞中的积聚,而外泌体处理后无明显变化。3、Real-time PCR结果显示,胃癌腹水上清处理后,SNU5和SNU16细胞中STAT3转录水平增加。Western Blot结果显示,腹水上清处理后,SNU5和SNU16细胞STAT3表达增加,在Tyr705位点磷酸化水平增加;总β-catenin水平不变,但非磷酸化β-catenin水平增加。流式细胞周期检测结果显示,磷酸化STAT3抑制剂处理后,SNU16细胞出现明显的G2/M期细胞周期阻滞,且Western Blot证实磷酸化STAT3被完全抑制。结论:1、成功构建了胃癌腹水肿瘤类器官模型,该模型能保留来源肿瘤细胞的特征。2、胃癌腹水中的外泌体不是腹水上清促进肿瘤类器官生长的主要原因。3、胃癌腹水上清中某些物质能激活肿瘤细胞中与肿瘤恶性生物学行为相关的WNT/β-catenin通路和STAT3信号通路。