花青素合成调节基因Bi/Cl转化东方百合‘索邦’的研究

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百合(Lilium spp.)作为全球著名的商品花卉,花色一直是其重要的观赏品质之,通过杂交育种的方法,已经培育出了除蓝紫色系以外的几乎所有色系。随着分子生物技术的兴起,百合基因工程研究取得了一些可喜的成果,但是目前百合的遗传转化效率较低,严重影响了百合分子育种的进程,所以有必要建立高效的遗传转化体系。目前,关于百合抗逆基因工程的研究报道较多,而关于百合花色基因工程的研究未见成功报道。因此,本论文以玉米(Zea mays)花青素合成调节基因Bi/Cl为目的基因,以期上调百合中花青素的含量,在4种百合受体系统建立的基础上,筛选出东方百合‘索邦’组培苗小鳞片作为最佳受体材料,研究了影响根癌农杆菌对‘索邦’遗传转化的因素,优化了百合遗传转化体系,通过分子检测,获得了单拷贝的转基因植株。主要研究成果如下:1.建立了4种百合的受体系统建立了“OT”杂种系百合’Bay watch’的无菌受体系统,比较了以鳞片和花器官作为外植体时的不定芽诱导和植株再生能力,综合5种外植体分化再生的结果,选择花丝作为最佳外植体材料,最适培养基为MS+0.5mg·L-1NAA+0.5mg·L-16-BA+0.2mg·L-12,4-D,筛选出了适宜淡黄花百合种子萌发的培养基:MS+0.01mg·L-1NAA+60g·L-1蔗糖;适宜‘索邦’、‘雷山3号’鳞片诱导不定芽的培养基分别为MS+2.0mg·L-16-BA+0.3mg·L-1NAA和MS+0.5mg·L-16-BA+0.2mg·L-1NAA。在继代培养中,筛选出了’Bay watch’组培苗继代增殖的适宜培养基为:MS+0.1-0.5mg·L-1NAA+1.0mg·L-16-BA,适宜‘索邦’、淡黄花、‘雷山3号’组培苗增殖培养的培养基为MS+2.0mg·L-16-BA+0.2mg·L-1NAA;适宜‘索邦’无菌苗鳞茎增大的培养基为3MS+0.5g·L-1AC+3.0mg·L-1PP333+80g·L-1蔗糖,适宜‘索邦’生根的培养基为1/2MS+0.1mg·L-1IBA。2.优化了农杆菌介导的东方百合‘索邦’的遗传转化体系(1)试验所用植物表达载体pBAC9075中含有抗草甘膦筛选标记基因,确定以草甘膦浓度2.0mg·L-1作为遗传转化后受体材料的抗性筛选浓度。(2)设置了7种类型改良MS培养基作为侵染液和共培养基,结果表明,当MS培养基中去除大量元素时抗性芽获得率相对较高,可达(18.31土1.71)%。在此条件下,将培养基中30g·L-1的蔗糖替换成70g·L-1的麦芽糖,可使抗性苗诱导率提高至(22.27±3.48)%;热激和超声波结合使用能够明显提高抗性苗的获得率,以42°C热激1.5min,120W超声波超声20s抗性苗获得率最高,可达(26.80±2.24)%。3.通过农杆菌介导的方法总共获得转Bi/Cl基因的‘索邦’抗性苗173株,少量抗性苗同对照相比有显著的颜色变化,小鳞茎出现紫红色。通过PCR以及Southern blot检测,获得1株单拷贝转基因植株,但生根后的转基因植株颜色与对照相比并未发生明显变化。
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