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黄嘌呤氧化酶（XOD）是一种多功能的金属蛋白酶,主要存在于心脏、肺和肝组织中,能催化次黄嘌呤和黄嘌呤氧化羟基化为尿酸,在体内核酸代谢中占据重要地位,是用于治疗由尿酸过量产生引起的高尿酸血症的有效靶标。合成的XOD抑制剂疗效显著的同时存在一定毒副作用。相比之下,部分天然产物如黄酮类和多酚类等兼有良好的XOD抑制活性与较低的毒性。藜蒿是一种集绿原酸、黄酮、多糖、三萜、多酚、生物碱等多种生物活性物质于一体的时令性野生蔬菜,自古以来就被人们食用甚至入药。咖啡酰基奎尼酸类化合物（CQAs）是一类由单个奎尼酸与一个或多个咖啡酸发生酯化反应形成的天然酚酸化合物,具有多种生理活性。本文对藜蒿叶中的CQAs进行提取,分析其在藜蒿叶中的组成及含量,测定其对XOD的体外抑制活性,并通过光谱学方法和分子对接技术探讨CQAs和XOD的体外相互作用机制,为开发藜蒿叶功能食品或提取物功能配料来预防或辅助治疗高尿酸血症给予理论支持。具体的研究方法、结果和结论如下:（1）响应曲面法优化乙醇回流提取藜蒿叶CQAs的最佳工艺参数为:乙醇体积分数为68%、液料比为32:1（mL:g）、提取温度为82℃、提取时间为2h、提取次数为1次。液质联用技术（UPLC-TOF-MS/MS）以及高效液相色谱法（HPLC）对藜蒿叶醇提物中CQAs进行定性和定量,测得藜蒿叶中含有九种CQAs,分别是:5-CQA、3-CQA、4-CQA、1-CQA、3,4-diCQA、3,5-diCQA、1,3-diCQA、4,5-diCQA和1,4-diCQA。使用外标法定量出3-CQA、4-CQA、3,4-diCQA、3,5-diCQA、1,3-diCQA和4,5-diCQA的含量分别为4.52±0.02、0.21±0.00、0.53±0.00、2.71±0.01、2.07±0.03和1.24±0.01 mg/g干叶,其中1,3-diCQA的含量较高,接近3-CQA（绿原酸）的一半,5-CQA、1-CQA和1,4-diCQA含量低下。（2）采用HPLC法测定八种常见且易获得的CQAs对XOD的体外抑制活性,310K温度下,8.33～133.33μM的浓度范围内,CQAs对XOD均表现一定的抑制活性,双咖啡酰基奎尼酸（diCQAs）的XOD抑制活性优于单咖啡酰基奎尼酸（mono CQAs）。其中,1,3-diCQA、3,4-diCQA、3,5-diCQA和4,5-diCQA这四种diCQAs的抑制活性比较强,利用SPSS软件计算出它们的IC50分别为58.03、134.65、174.66和95.25μM(别嘌呤醇IC50为14.85μM),而1,5-diCQA、3-CQA、4-COA和5-CQA的抑制能力较弱。1,3-diCQA在八种CQAs中抑酶活性最佳,IC50约为别嘌呤醇的4倍。（3）通过荧光光谱法研究八种CQAs和XOD之间的相互作用方式,发现八种CQAs均以静态猝灭方式使XOD的内源荧光强度降低;分子间结合位点数n接近1或大于1,推断CQAs与酶存在一个或一个以上的结合位点;通过结合常数的大小,判断CQAs与酶亲和力强度由大到小的顺序为:1,3-diCQA＞3,5-diCQA＞4,5-diCQA＞3,4-diCQA＞1,5-diCQA＞3-CQA＞4-CQA＞5-CQA,diCQAs与XOD的亲和力强于mono CQAs;疏水相互作用在维持CQAs-XOD复合物稳定方面扮演着重要角色,此外,氢键是5-CQA、1,5-diCQA、3,4-diCQA和3,5-diCQA与XOD结合的另一重驱动力。圆二色光谱研究表明,八种CQAs与XOD的相互作用会诱导酶的二级结构变化,随着八种小分子物质浓度的上升,酶α-螺旋含量提高,而β-折叠和无规则卷曲含量下降。从两种光谱学的研究结果,可以推断八种CQAs均能够强弱不同地结合至XOD上,发挥出大小不一的抑酶效果,抑制的机理可能是α-螺旋含量升高使XOD结构更为紧凑,底物黄嘌呤难以定位至钼（Mo）活性腔,致使酶催化活性降低。（4）利用分子对接技术,采用拉马克遗传算法,分别将八种CQAs与XOD的Mo活性中心和黄素腺嘌呤二核苷酸辅因子（FAD）活性区域对接运行100次。对接结果显示八种CQAs与XOD两个活性区域的结合能均为负值,均能发生稳定结合,且与酶FAD区域的结合能更小,结合作用更稳定,优先结合于FAD区;CQAs在FAD区的结合可能会导致内源的生色基团TRP336和PHE270由XOD内部的疏水区向亲水环境转移,从而发生荧光猝灭现象;从结合能的大小,判断八种CQAs与XOD的亲和力强度由大到小的顺序为:1,3-diCQA＞3,5-diCQA＞4,5-diCQA＞3,4-diCQA＞1,5-diCQA＞3-CQA＞5-CQA＞4-CQA,diCQAs与XOD的亲和力更强,此项结论与荧光实验的结论一致,为体外抑酶实验中diCQAs的抑酶效果优于mono CQAs的结果提供了理论依据;通过CQAs与其结合位点周围的氨基酸残基的相互作用,推断氢键和疏水相互作用是维持CQAs-XOD复合物稳定的主要作用力。此次对接以别嘌呤醇为阳性对照组,发现别嘌呤醇更易与酶的Mo活性中心结合,推断CQAs的酶抑制机理与别嘌呤醇的不同,不是与底物黄嘌呤竞争Mo活性位点,而可能是阻断酶催化反应过程电子传递。