卵巢癌是严重威胁妇女健康的高度恶性肿瘤,其早期无典型临床症状及体征,一旦出现症状多属晚期,病死率居妇科恶性肿瘤之首。虽然肿瘤细胞减灭术和以,铂类为基础的联合化疗使其患者5年生存率有所改善,但卵巢癌临床诊治并无实质性进展。这主要由于缺乏临床实用的早期诊断手段和疗效持久的治疗方案,其根本原因在于对卵巢癌的早期诊断、发生发展、预后等的分子机制认识不清,因此预测卵巢癌的预后,寻找卵巢癌早期筛查的手段和卵巢癌新的治疗靶点仍旧是卵巢癌研究的重点和难点。上皮性卵巢癌是卵巢肿瘤的主要类型,它有四种主要的组织学亚型:浆液型、子宫内膜样、粘液型和透明细胞型;其中高级浆液性卵巢癌(HGSOC)约占全部卵巢癌的70%左右,易发生腹腔转移,预后极差,是上皮性卵巢癌中最常见也是恶性程度最高的亚型。本研究主要对浆液性卵巢癌进行研究,后文均以卵巢癌称之。Notch3是参与调控细胞发育和分化的Notch家族的重要成员之一。既往研究表明,Notch3的失调与多种肿瘤的发生发展密切相关,包括肺癌,乳腺癌,卵巢癌等。2011年TCGA对卵巢癌进行的基因组和表达谱分析发现Notch3在卵巢癌中存在基因扩增和调控异常,并且有研究证实在66%卵巢癌中存在Notch3基因扩增及过度表达,其异常表达与卵巢癌的不良预后密切相关。然而,参与Notch3通路的潜在分子靶点尚未被完全理解。SUSD2是单通道1型膜蛋白,常表达于骨髓间充质干细胞,血管周围平滑肌细胞,以及许多肿瘤细胞系。之前的研究表明,在许多肿瘤中(例如,肝癌,肺癌等),SUSD2表达水平低于正常组织,过表达SUSD2后可抑制肿瘤细胞的转移和增殖。但在乳腺癌中,SUSD2的表达相比于乳腺良性肿瘤增加,并且过表达SUSD2后可促进乳腺癌细胞的转移,诱导T细胞凋亡;在胃癌中SUSD2也参与了肿瘤细胞的恶性行为过程。由此可见,在不同类型的肿瘤组织中,SUSD2的表达与肿瘤发生及进展的相关性是存在较大差异的。并且有研究发现SUSD2可作为Notch3的潜在下游基因,基于Notch3与卵巢癌不良预后的关系,提示SUSD2在卵巢癌的发展过程中存在一定的作用。因此本课题组推测SUSD2或许也与卵巢癌的恶性生物学行为相关联,影响卵巢癌预后,这将为卵巢癌的治疗提供新的思路。细胞周期蛋白G1(CCNG1)是一种细胞周期蛋白G家族蛋白,能够调节细胞的生长。尽管CCNG1的功能尚不十分明确,但有已不少研究表明CCNG1在许多类型的恶性肿瘤中存在异常表达,如EOC、肝细胞癌和肺癌,并且参与了肿瘤细胞的增殖转移等过程。有研究显示,在肝癌中,Notch3能够调节CCNG1的表达,因此本课题组猜想在卵巢癌中,CCNG1与Notch3之间或许存在一定的关联,并参与了卵巢癌的恶性行为过程。本课题也基于此对CCNG1在卵巢癌发展过程中的作用进行探讨。本课题主要明确SUSD2、CCNG1与Notch3在卵巢癌中的关系,探讨它们在卵巢癌中的表达情况、发生发展中的作用并研究其具体的作用机制,为卵巢癌的诊治提供新的思路。研究内容分为以下三部分:一、SUSD2、CCNG1在卵巢癌中的表达情况及其临床意义。二、SUSD2促进卵巢癌转移,化疗耐药及其相关的分子机制研究。三、CCNG1在卵巢癌发生发展过程中的作用及其机制研究。第一部分:SUSD2、CCNG1在卵巢癌中的表达情况及其临床意义研究目的:卵巢癌,尤其是浆液性卵巢癌,作为危害女性健康的妇产恶性肿瘤,其病死率高,预后差。重要的原因在于临床上缺乏早期有效的分子标记物及治疗靶点。Notch3被证实在卵巢癌中对肿瘤的转移和耐药性的产生至关重要,因此通过对Notch3的下游调节基因的研究,寻找有效的分子靶点将有望改善卵巢癌的预后。SUSD2是一种含有822个氨基酸Ⅰ型膜蛋白,参与了许多肿瘤发生发展过程,但其在卵巢癌中的作用机制尚未明确。CCNG1是细胞周期蛋白,能够促进卵巢癌细胞的增殖,但其对卵巢癌细胞的转移及化疗耐药作用并不清楚。本研究通过明确SUSD2、CCNG1与Notch3的关系,研究SUSD2、CCNG1在卵巢癌中的表达情况,并将它们的表达情况与卵巢癌患者临床病理参数进行分析,进而发现SUSD2、CCNG1在卵巢癌发生、发展过程中所起的作用。材料和方法:构建卵巢癌Notch3过表达及干扰细胞系,利用Westen-blot(WB),RT-qPCR等检测Notch3对SUSD2及CCNG1的调节作用。收集卵巢癌标本,并以正常FTE组织进行对照,利用免疫组化,WB,RT-qPCR等检测二者之中SUSD2、CCNG1表达量的差异。根据免疫组化染色情况,将患者划分为高表达组和低表达组,汇总卵巢癌患者的临床信息,分析SUSD2、CCNG1表达情况与预后的关系。结果:在卵巢癌细胞系中过表达Notch3能够上调SUSD2、CCNG1的表达;干扰Notch3后,SUSD2、CCNG1的表达均降低。SUSD2、CCNG1在卵巢癌中表达明显高于正常对照:免疫组化检测发现SUSD2、CCNG1在卵巢癌中的表达明显高于输卵管伞中的表达;RT-qPCR及Westen-blot(WB)实验验证了CCNG1在卵巢癌中存在高表达。生存分析显示:SUSD2及CCNG1高表达组相比SUSD2及CCNG1低表达组预后均明显较差,SUSD2高表达组卵巢癌患者的2年存活率及2年无进展生存率时间均低于SUSD2低表达组患者,并且SUSD2高表达与卵巢癌的大网膜转移率,淋巴结转移率和化疗耐药呈正相关。通过联合SUSD2和CCNG1的表达情况与卵巢癌预后进行分析发现,SUSD2和CCNG1同时高表达的卵巢癌患者组的总生存期(OS)和无进展生存期(PFS)明显短于SUSD2和CCNG1同时低表达的卵巢癌患者组。结论:在卵巢癌中Notch3能够调节SUSD2和CCNG1的表达。SUSD2和CCNG1在卵巢癌中存在高表达,且高表达的SUSD2、CCNG1与卵巢癌的不良预后相关,联合检测分析SUSD2和CCNG1的表达能更好地预测卵巢癌的预后情况。第二部分:SUSD2促进卵巢癌转移,化疗耐药及其相关的分子机制研究研究目的:卵巢癌具有致死率高,预后差的特点,其肿瘤细胞的侵袭能力强,易发生早期及广泛的盆腔和大网膜转移而导致手术无法完全切除肿瘤。第一部分结果中表明SUSD2高表达与卵巢癌的肿瘤转移呈正相关,提示SUSD2参与卵巢癌的转移过程。并且,化疗耐药后复发也是引起卵巢癌不良预后的一个重要因素。目前尚不明确SUSD2在卵巢癌化疗耐药中是否发挥作用。第一部分结果中SUSD2的高表达与卵巢癌铂耐药相关,提示SUSD2参与卵巢癌细胞的铂耐药过程。本研究目的是通过调控卵巢癌细胞系中SUSD2的表达水平来检测SUSD2对转移能力及化疗耐药过程的影响,为卵巢癌的治疗提供新的思路。材料和方法:选取合适的卵巢癌细胞系(SKOV3,CAOV3,HO8910),构建SUSD2过表达质粒和干扰质粒,利用慢病毒包装感染体系感染卵巢癌细胞系,使其低表达或过表达SUSD2基因,筛选出稳定的细胞系。利用Transwell实验检测SUSD2对卵巢癌细胞转移能力的影响;利用Westen-blot方法对上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关蛋白进行检测,建立SUSD2改变与EMT的关联;WB方法检测细胞表面粘连蛋白EpCAM的改变情况,用Rescue实验检测EpCAM的改变对SUSD2与细胞发生EMT之间的作用;并且利用裸鼠尾静脉注射癌细胞验证SUSD2对卵巢癌细胞肺转移的影响。对卵巢癌细胞进行一定浓度的顺铂药物刺激,利用WB检测卵巢癌细胞SUSD2表达水平是否随顺铂作用时间的变化而发生改变;利用MTT法检测干扰SUSD2或过表达SUSD2对卵巢癌细胞顺铂化疗敏感性的影响;利用WB及qRT-PCR检测SUSD2过表达或低表达后自噬相关分子的变化情况,以明确SUSD2对自噬的影响;GFP-RPF-LC3腺病毒感染SKOV3细胞后,荧光显微镜下观察SUSD2改变对自噬的影响:利用氯喹来抑制细胞自噬后检测过表达SUSD2细胞系对顺铂敏感性的影响。结果:通过Transwell实验表明:SUSD2过表达后,卵巢癌细胞侵袭迁移能力明显增强,干扰SUSD2后细胞侵袭迁移能力明显减弱。WB检测显示SUSD2可以调控卵巢癌细胞EMT的发生,主要表现为过表达SUSD2后上皮性标志物E-cadherin(E-CAD)下调,N-cadherin(N-CAD)上调,EMT转录因子SLUG上调;而SUSD2敲低后表达则相反;干扰SUSD2后,EpCAM表达降低;过表达SUSD2则可上调卵巢癌细胞EpCAM的表达;Rescue实验证实了下调EpCAM后可以降低SUSD2过表达引起的E-CAD下调水平,并且削弱SUSD2过表达引起的卵巢癌细胞增强的转移能力;通过体内实验证实干扰SUSD2可以抑制卵巢癌细胞在裸鼠中的肺转移能力。卵巢癌细胞施加顺铂刺激后,WB显示随着顺铂作用时间延长,细胞SUSD2表达增加。加药MTT显示,过表示SUSD2后卵巢癌细胞对顺铂的敏感性降低,其半数致死量(IC50)显著高于正常对照组;敲低SUSD2的表达后卵巢癌细胞对顺铂的敏感性增强,IC50明显低于正常对照组。通过检测自噬相关分子发现:过表达SUSD2诱导卵巢癌细胞发生自噬,而降低SUSD2表达则抑制卵巢癌细胞自噬水平。荧光显微镜下观察到SUSD2过表达后,自噬小体增多。氯喹抑制细胞自噬后,过表达SUSD2的卵巢癌细胞增强的耐药性被削弱。结论:在卵巢癌中SUSD2的过表达可以通过EpCAM的上调来调节EMT相关分子的变化,从而诱导卵巢癌细胞发生EMT,最终增强卵巢癌的转移能力;并且SUSD2可以通过诱导自噬,促进卵巢癌细胞铂化疗耐药。第三部分:CCNG1在卵巢癌发生发展过程中的作用及其机制研究研究目的:卵巢癌病死率高,其5年存活率不到50%,这不仅仅是由于卵巢癌细胞侵袭能力强,易转移,还因为其对药物的原发性或继发性耐药,病情缓解后易复发。Notch3在卵巢癌的转移和耐药过程中扮演着重要的角色,第一部分结果中提示Notch3能够调节CCNG1的表达。目前尚不明确CCNG1在卵巢癌转移和化疗耐药过程中的作用及机制。CCNG1的高表达与卵巢癌不良预后相关,提示CCNG1可能参与卵巢癌细胞的转移和顺铂耐药过程。本研究主要探讨CCNG1对肿瘤细胞转移能力及化疗耐药的影响。材料与方法:选取合适的卵巢癌细胞系(A2780,H08910),构建CCNG1过表达质粒和干扰质粒,利用慢病毒包装感染体系感染卵巢癌细胞系,改变细胞的CCNG1表达水平;过表达及干扰效率被验证后,通过Transwell检测卵巢癌细胞系CCNG1过表达或干扰后对细胞迁移和侵袭能力的影响;利用WB检测卵巢癌细胞EMT相关蛋白表达的变化;并且利用裸鼠尾静脉注射癌细胞验证CCNG1对卵巢癌细胞肺转移的影响;对卵巢癌细胞进行一定浓度的顺铂药物刺激,利用WB检测卵巢癌细胞CCNG1表达水平是否随顺铂作用时间的变化而发生改变;利用MTT法检测干扰CCNG1或过表达CCNG1对卵巢癌细胞顺铂化疗敏感性的影响。结果:Transwell结果显示CCNG1过表达后,卵巢癌细胞侵袭迁移能力明显增强,干扰CCNG1后细胞侵袭迁移能力明显减弱,且细胞中EMT标志分子(N-CAD,SLUG,SNAIL)相应发生变化:过表达CCNG1后上皮性标志物N-CAD上调,EMT转录因子SLUG和SNAIL上调,而CCNG1敲低后表达则相反;通过体内实验证实干扰CCNG1可以抑制卵巢癌细胞在裸鼠中的肺转移能力;A2780.H08910细胞施加顺铂刺激后,WB结果显示随着顺铂作用时间延长,细胞中的CCNG1表达增加;加药MTT显示,敲低CCNG1的表达后卵巢癌细胞对顺铂的耐药性减弱,IC50明显低于正常对照组。结论:卵巢癌中CCNG1可增强卵巢癌的转移能力,CCNG1促进肿瘤的转移能力是通过介导肿瘤细胞发生EMT实现的;并且CCNG1可以促进卵巢癌顺铂耐药。