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【研究背景与目的】高糖(High glucose,HG)对中枢神经系统具有毒性作用,可诱导神经细胞衰老。自噬流的阻断与神经系统疾病的发生发展密切相关。沉默信息调节因子1(Silence signal regulatingfactor 1,SIRT1)是机体重要的抗衰老蛋白,具有调节细胞自噬流的作用。我们以往研究发现硫化氢(Hydrogen sulfide,H2S)可以拮抗同型半胱氨酸和甲醛等诱导的神经细胞衰老并上调神经元中SIRT1表达。故本课题拟探讨H2S是否能拮抗HG诱导的HT22细胞衰老,自噬流是否介导H2S对HG诱导HT22细胞衰老的拮抗作用,以及SIRT1是否参与自噬流介导的H2S对HG诱导的HT22细胞衰老的拮抗作用?【方法】细胞计数试剂盒(Cell counting Kit-8,CCK8)检测HT22细胞活性;衰老相关β-半乳糖苷酶染色法(Senescence Associated acidic-β-Galactosidas,SA-β-Gal)检测β-半乳糖苷酶阳性细胞率;台盼蓝染色法(Trypan blue stain)求取细胞生长曲线;蛋白免疫印迹法(Western Blot)分别检测细胞衰老相关蛋白(p16INK4a和p21CIPl)、自噬相关蛋白(LC3和p62/SQSTMI)以及SIRT1蛋白的表达。透射电镜观察HT22细胞的自噬结构。【结果】1.NaHS(H2S供体,100、200、400μM)预处理HT22细胞30 min能明显抑制HG诱导的HT22细胞活力降低,表明H2S可拮抗HG诱导的HT22细胞损伤。2.NaHS(200μM)预处理HT22细胞30 min能明显逆转HG诱导的SA-β-Gal染色阳性细胞率增加、细胞生长抑制以及细胞衰老相关蛋白(p16INK4a和p21CIPL)表达上调,表明H2S亦可拮抗HG诱导的HT22细胞衰老。3.HG(27、45 mg/mL)处理HT22细胞48 h能显著上调LC3II/LC3I的比值和p62/SQSTMI蛋白表达,提示HG可能阻断HT22细胞自噬流。4.NaHS(200μM)预处理HT22细胞30 min明显逆转HG引起的HT22细胞自噬体数量的增加、LC3II/LC3I的比值和p62/SQSTMI蛋白表达的上调,表明H2S可改善HG对HT22细胞自噬流的阻断作用。5.CQ(自噬流后期阻断剂,10μM)预处理HT22细胞30 min明显逆转H2S对HG抑制HT22细胞自噬流的改善作用和对HG诱导HT22细胞衰老的抑制作用,而3-MA(自噬流前期阻断剂,10 m M)预处理HT22细胞30 min对H2S改善HG阻断的HT22细胞自噬流和拮抗HG诱导HT22细胞衰老没有明显的影响,表明自噬流介导了H2S对HG诱导HT22细胞衰老的拮抗作用。6.H2S上调HT22细胞SIRT1的表达,并逆转HG下调HT22细胞SIRT1表达的作用。7.Sirtinol(SIRT1抑制剂,15μM)预处理HT22细胞30 min可明显逆转H2S对HG抑制细胞活力、诱导细胞衰老、阻断细胞自噬流的拮抗作用,表明SIRT1参与自噬流介导的H2S对HG诱导HT22细胞衰老的拮抗作用。【结论】H2S通过上调SIRT1改善HG对HT22细胞自噬流的阻断作用而发挥其对HG诱导HT22细胞衰老的拮抗作用。