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第一部分基于线粒体自噬的薯蓣皂苷元改善T2DM大鼠睾丸损伤的机理研究目的探讨薯蓣皂苷元能否通过影响睾丸组织线粒体自噬而改善T2DM大鼠睾丸损伤。方法以高脂饲料加链脲佐菌素注射诱导T2DM脂代谢紊乱所致睾丸损伤大鼠模型,实验大鼠随机分组设模型组、薯蓣皂苷元低剂量组、薯蓣皂苷元中剂量组、薯蓣皂苷元高剂量组和二甲双胍阳性药对照组,另以正常大鼠设正常对照组。药物持续干预12周后,后面相关实验指标检测分析。各组大鼠生化方法测甘油三酯(Triglycerides,TG)和血糖、酶联免疫吸附测定法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)测血清胰岛素(Insulin,INS)水平和血清睾酮水平,睾丸组织苏木精和伊红(Hematoxylin-Eosin staining,HE)染色法光镜下病理学检查和电镜下超微观结构检查,DHE荧光探针标记法测睾丸组织活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平,JC-1荧光探针标记法测睾丸组织细胞线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential,△Ψm)水平,Calcein-AM荧光探针标记法测睾丸组织细胞线粒体通透性转换孔(Mitochondrial permeability transition pore,MPTP)开放程度,ELISA法测睾丸组织细胞浆细胞色素C(Cytochrome C,Cyt c)含量,荧光定量逆转录聚合酶链式反应(Quantitative reverse transcription PCR,RT-q PCR)检查睾丸组织的类固醇激素合成急性调控蛋白(Steroidogenic acute regulatory proteins,St AR)的信使核糖核酸(messenger RNA,m RNA)表达,蛋白质免疫印迹法(Western blot,WB)检查大鼠睾丸组织的St AR蛋白、胰岛素信号通路相关蛋白IRS-1、p-IRS-1(Ser307)、AKT、p-AKT(Ser473)、JNK、p-JNK(Thr183/Tyr185)和线粒体自噬相关蛋白PINK1、Parkin、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p62蛋白的表达。结果与正常对照组比较,模型组大鼠血清TG水平异常升高,血清睾酮水平异常低下,模型组大鼠睾丸重量显著减轻,HE染色形态学检查显示睾丸组织细胞结构病理改变明显,睾丸组织St AR m RNA和St AR蛋白表达水平均明显下降;与模型组比较,薯蓣皂苷元组和二甲双胍组大鼠血清TG水平均显著降低,血清睾酮水平均显著升高,薯蓣皂苷元组和二甲双胍组大鼠睾丸重量显著增加,HE染色形态学检查显示睾丸组织细胞结构病理明显减轻,睾丸组织St AR m RNA和St AR蛋白表达水平均显著下降。与正常对照组比较,模型组大鼠睾丸组织ROS水平异常增加,出现MPTP明显异常开放,△Ψm水平显著下降,睾丸组织细胞胞浆Cyc c含量异常增加;与模型组比较,薯蓣皂苷元组和二甲双胍组大鼠睾丸组织ROS水平明显减少,大鼠睾丸组织细胞MPTP开放程度显著减小,△Ψm水平显著升高,睾丸组织细胞胞浆Cyc c含量显著减少。与正常对照组比较,模型组大鼠睾丸组织JNK(Thr183/Tyr185)磷酸化水平和IRS-1(Ser307)磷酸化水平均异常增高,AKT(Ser473)磷酸化水平异常降低;与模型组比较,薯蓣皂苷元组和二甲双胍组大鼠睾丸组织JNK(Thr183/Tyr185)磷酸化水平和IRS-1(Ser307)磷酸化水平均显著降低,AKT(Ser473)磷酸化水平显著升高。电镜超微结构图显示正常对照组大鼠睾丸间质细胞内各细胞器形态完整清晰,未见线粒体自噬小体。模型组大鼠睾丸间质细胞各细胞器形态破坏不清晰,可见线粒体自噬小体沉积物,而薯蓣皂苷元组和二甲双胍组大鼠睾丸间质细胞内各细胞器形态较完整清晰,亦有线粒体自噬小体沉积物。正常对照组大鼠睾丸组织线粒体自噬相关蛋白PINK1、Parkin、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p62蛋白表达水平均很低;与正常对照组比较,模型组大鼠线粒体自噬相关蛋白PINK1、Parkin、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p62蛋白表达水平均显著升高,尤其是p62蛋白表达水平升高很突出;与模型组比较,薯蓣皂苷元组和二甲双胍组大鼠睾丸组织线粒体自噬相关蛋白Parkin、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达水平均显著升高,p62蛋白表达水平均显著降低。结论睾丸组织ROS诱发的PINK1-Parkin信号通路依赖性线粒体自噬反应功能障碍可能是T2DM脂代谢紊乱大鼠睾丸损伤的重要病理生理机制,薯蓣皂苷元和二甲双胍均具有对T2DM脂代谢紊乱大鼠睾丸损伤的治疗作用,并且薯蓣皂苷元的作用机制与薯蓣皂苷元能激活大鼠睾丸组织PINK1-Parkin信号通路依赖性线粒体自噬反应和改善大鼠睾丸组织PINK1-Parkin信号通路依赖性线粒体自噬反应功能障碍有关,亦与薯蓣皂苷元能清除大鼠睾丸组织ROS有关。第二部分基于线粒体自噬的薯蓣皂苷元改善棕榈酸诱导睾丸间质细胞脂毒性损伤的机理研究目的探讨薯蓣皂苷元能否通过影响睾丸间质细胞线粒体自噬而改善棕榈酸诱导睾丸间质细胞脂毒性损伤。方法以棕榈酸(Palmitic acid,PA)诱导睾丸间质细胞系TM3细胞脂毒性损伤模型,在薯蓣皂苷元机制研究中我们还制备靶向PINK1基因si RNA重组慢病毒转染TM3细胞,然后进行PA处理和药物干预。本部分的薯蓣皂苷元药效研究实验分组为正常对照组、模型组、1μM薯蓣皂苷元治疗组、3μM薯蓣皂苷元治疗组、10μM薯蓣皂苷元治疗组、10μM二甲双胍阳性药对照组。药效指标检测为:油红O染色观察各组TM3细胞内脂质,生化方法测各组TM3细胞TG含量,荧光法检查各组TM3细胞葡萄糖消耗水平,ELISA检查各组TM3细胞睾酮分泌水平。本部分的薯蓣皂苷元作用机制研究实验分组为正常对照组、模型组、10μM薯蓣皂苷元治疗组、(PA+空载慢病毒)组、(PA+si PINK1-慢病毒)组、(PA+si PINK1-慢病毒+10μM薯蓣皂苷元)组、(PA+10μM薯蓣皂苷元+ROS清除剂N-acetylcysteine)组、(PA+si PINK1-慢病毒+10μM薯蓣皂苷元+ROS清除剂N-acetylcysteine)组。作用机制指标检查:DHE荧光探针标记法测各组TM3细胞ROS水平,JC-1荧光探针标记法测各组TM3细胞△Ψm水平,Calcein-AM荧光探针标记法测各组TM3细胞MPTP开放程度,萤光素酶催化法测各组TM3细胞腺苷三磷酸(ATP)含量,RT-q PCR检查各组TM3细胞St AR m RNA表达,WB检查各组TM3细胞的St AR蛋白、胰岛素信号通路相关蛋白IRS-1、p-IRS-1(Ser307)、AKT、p-AKT(Ser473)、JNK、p-JNK(Thr183/Tyr185)和线粒体自噬相关蛋白PINK1、Parkin、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p62蛋白的表达。结果本部分药效实验中,与正常对照组比较,模型组TM3细胞TG含量异常增高,脂质沉积明显,葡萄糖消耗显著下降,睾酮分泌水平异常降低;而与模型组比较,薯蓣皂苷元治疗组TM3细胞和二甲双胍阳性药对照组TM3细胞TG含量均显著降低,脂质沉积明显减少,葡萄糖消耗均显著增加,睾酮分泌水平均显著升高。本部分药物作用机制研究实验中,与正常对照组比较,模型组TM3细胞和(PA+空载慢病毒)组TM3细胞ROS水平均异常增加,均出现MPTP明显异常开放,△Ψm水平均显著下降,ATP含量均显著减少,线粒体自噬相关蛋白PINK1、Parkin、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p62蛋白表达水平均显著升高,尤其是p62蛋白表达水平升高很突出,因此胰岛素信号通路相关蛋白JNK(Thr183/Tyr185)磷酸化水平和IRS-1(Ser307)磷酸化水平均异常增高,AKT(Ser473)磷酸化水平均异常降低,而St AR m RNA和St AR蛋白表达水平均显著降低。与模型组比较,(PA+si PINK1-慢病毒)组TM3细胞ROS水平进一步异常增加,出现MPTP异常开放程度加大,△Ψm水平进一步显著下降,ATP含量进一步显著减少,线粒体自噬相关蛋白PINK1表达水平显著降低,但线粒体自噬相关蛋白Parkin、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p62蛋白表达水平无显著性差异,因此胰岛素信号通路相关蛋白JNK(Thr183/Tyr185)磷酸化水平和IRS-1(Ser307)磷酸化水平均进一步异常增高、AKT(Ser473)磷酸化水平无显著性差异,而St AR m RNA表达水平显著降低,St AR蛋白表达水平无显著性差异。本部分药物作用机制研究实验中,与模型组比较,10μM薯蓣皂苷元治疗组TM3细胞和(PA+10μM薯蓣皂苷元+ROS清除剂N-acetylcysteine)组TM3细胞ROS水平均显著减少,均出现MPTP开放程度显著减小,△Ψm水平均显著升高,ATP含量均显著增加,线粒体自噬相关蛋白PINK1、Parkin、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达水平均显著升高,但p62蛋白表达水平均显著降低。因此胰岛素信号通路相关蛋白JNK(Thr183/Tyr185)磷酸化水平和IRS-1(Ser307)磷酸化水平均显著降低,AKT(Ser473)磷酸化水平均显著升高,而St AR m RNA和St AR蛋白表达水平均显著升高。本部分药物作用机制研究实验中,与模型组比较,(PA+si PINK1-慢病毒+10μM薯蓣皂苷元)组TM3细胞和(PA+si PINK1-慢病毒+10μM薯蓣皂苷元+ROS清除剂N-acetylcysteine)组TM3细胞ROS水平均进一步异常增加,均出现MPTP异常开放程度加大,△Ψm水平均进一步显著下降,ATP含量均进一步显著减少,线粒体自噬相关蛋白PINK1蛋白表达水平均显著降低,线粒体自噬相关蛋白Parkin、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达水平均无统计学显著差异,而p62蛋白表达水平均显著降低,而因此胰岛素信号通路相关蛋白JNK(Thr183/Tyr185)磷酸化水平、IRS-1(Ser307)磷酸化水平和AKT(Ser473)磷酸化水平均无显著性差异,而St AR m RNA表达水平均减少,St AR蛋白表达水平无显著性差异。结论ROS诱发的PINK1-Parkin信号通路依赖性线粒体自噬反应功能障碍亦可能是PA诱导的TM3细胞损伤的重要病理生理机制。薯蓣皂苷元具有显著的抗PA诱导的TM3细胞脂毒性损伤作用,其作用机制与薯蓣皂苷元能激活PA诱导的TM3细胞PINK1-Parkin信号通路依赖性线粒体自噬反应和改善PA诱导的TM3细胞PINK1-Parkin信号通路依赖性线粒体自噬反应功能障碍有关,亦与薯蓣皂苷元能清除PA诱导的TM3细胞ROS有关。薯蓣皂苷元作用机制研究显示薯蓣皂苷元对PA诱导的TM3细胞PINK1-Parkin信号通路依赖性线粒体自噬反应的多个环节都有作用。