壳聚糖和聚乙烯亚胺作为PolyI:C/OVA药物载体的研究

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免疫疗法是通过激发机体免疫系统从而起到识别和杀伤肿瘤细胞作用的一种新型肿瘤治疗方法。聚肌胞(PolyI:C)是一种人工合成的双链RNA,具有免疫调节的作用,可用于免疫疗法。但PolyI:C在体内运输时会受到一些阻碍而影响表达,这就需要开发合适的药物载体来递送PolyI:C。本研究以壳聚糖(CS)和聚乙烯亚胺(PEI)为主体构建了三种不同的药物载体来递送PolyI:C以及模拟抗原卵清蛋白(OVA)。对三种药物载体及包覆PolyI:C和OVA得到的纳米粒子进行了理化性质的研究,主要研究内容和结果如下:(1)通过CDI偶联法制备了CS接枝PEI共聚物(C-g-P)作为递送PolyI:C的药物载体。傅里叶变换红外光谱(FT-IR)、核磁共振(~1H-NMR)和元素分析结果表明PEI成功的接枝到了CS上,得到了PEI接枝率分别为15.05%,32.71%,50.49%的接枝共聚物C-g-P-x(x=1,2,3)。细胞毒性的结果表明,C-g-P-x(x=1,2,3)具有较低的细胞毒性,细胞存活率都在80%以上。通过静电自组装将C-g-P-x(x=1,2,3)接枝共聚物、PolyI:C和OVA结合制得了不同N/P比的纳米粒子C-g-P-x-PolyI:C/OVA(C-g-P-x-PO,x=1,2,3)。琼脂糖凝胶电泳结果表明,接枝共聚物能很好的与PolyI:C结合并且能保护PolyI:C抗核酸酶降解。纳米粒子的溶液稳定性研究表明,N/P=80:1的C-g-P-1-PO纳米粒子溶液具有最好的稳定性,稳定时间>30天。紫外测试、透射电镜(TEM)结果表明,N/P=80:1的C-g-P-1-PO对于OVA的包封率为60.6%并且纳米粒子具有合适的尺寸和规则的形状能被细胞所内吞。体外免疫测试结果表明包覆PolyI:C的纳米粒子能促进肿瘤坏死因子α(TNF-α)与干扰素γ(IFN-γ)的分泌,具有良好的免疫应答效果。(2)本研究设计了一种简单易行的方法:将壳寡糖(COS)和PEI共混体系作为PolyI:C的药物载体。采用静电自组装的方法将COS、PEI与PolyI:C、OVA结合,并通过不同的加料方式制备了一系列PEI浓度的纳米粒子CP-P-O-x(x=1,2,3)。纳米粒子的溶液稳定性研究表明,只有加入的PEI浓度在5.0%以上时,纳米粒子溶液才能稳定。细胞存活率的实验结果表明,COS与PEI的共混物具有较低的细胞毒性。琼脂糖凝胶电泳结果表明,CP-P-O-x(x=1,2,3)很好地包覆了PolyI:C并保护其不被核酸酶所降解。紫外测试的结果显示,纳米粒子对OVA的包封率都在75%以上。TEM的结果表明,CP-P-O-x(x=1,2,3)具有规则的形状和合适的粒径,易被细胞摄取和表达。体外免疫测试的结果表明,由于PolyI:C的加入,不管OVA负载在内部还是表面,CP-P-O-x(x=1,2)都明显促进了细胞因子TNF-α与IFN-γ的分泌。加料方式主要是对纳米粒子的形貌和尺寸影响较大,对溶液稳定性、OVA包封率、保护PolyI:C的抗核酸酶降解能力及免疫性能影响不大。(3)采用希夫碱反应对CS-g-PEI共聚物进行聚乙二醇(PEG)化修饰,得到了具有p H响应性的接枝共聚物C-g-P-g-PEG。~1H-NMR结果表明,在正常生理条件下(p H=7.4),PEG成功的接枝到了CS-g-PEI共聚物上,而在微酸性条件下(p H=5.0),PEG成功的与接枝共聚物分离。细胞毒性测试结果表明,C-g-P-g-PEG接枝共聚物具有低的细胞毒性,其细胞存活率在95%以上。PEG接枝率为47%的接枝共聚物C-g-P-g-PEG通过静电作用紧密压缩PolyI:C和OVA得到了不同N/P比的纳米粒子C-g-P-g-PEG-PO。溶液稳定性研究表明,N/P比为40:1的纳米粒子溶液稳定性最好。琼脂糖凝胶电泳的结果表明,C-g-P-g-PEG能够与PolyI:C紧密结合并保护其抗核酸酶降解。TEM、紫外测试和体外免疫测试结果表明,N/P比为40:1的纳米粒子的粒径为58 nm,对OVA的包封率为49.78%,能够显著促进细胞因子TNF-α与IFN-γ的分泌。
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