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放射治疗是目前临床主要的肿瘤治疗手段，但由于肿瘤临近部位正常组织的放射损伤和某些肿瘤的辐射抗性问题，放疗的疗效和应用受到一定限制。因此，寻求减少局部辐射剂量、增强抑瘤效应的治疗措施，已成为目前放射肿瘤学研究面临的重要课题。辐射敏感启动子Egr-1(early growth response 1)的发现为放疗和基因治疗的有效结合提供了新思路，奠定了恶性肿瘤基因放射治疗的理论基础。本实验以多基因表达载体为基因导入系统，建立pEgr-IL18-B7.1的基因-免疫-放射治疗的新模式，试图充分发挥三者各自的优势，达到治疗癌症的目的。一是利用电离辐射直接杀伤肿瘤细胞、抑制肿瘤血管形成和诱导Egr-1基因转录的多重作用，二是利用Egr-1基因启动子中的CArG元件诱导连接于其下游的IL-18和B7-1基因的表达[6]，三是通过免疫因子的局部和全身免疫调节作用增强抗癌免疫功能，并利用共刺激分子的协同作用，促进T细胞活化。这样既可降低辐射剂量，减轻或避免正常组织损伤，又可诱导B7.1和IL-18的表达，发挥其调动抗癌免疫功能和抗血管形成的作用，达到抑制肿瘤生长和转移的目的，将为肿瘤治疗开辟新途径。重组质粒的构建1.1 小鼠IL-18基因cDNA克隆及鉴定本实验根据mIL-18的cDNA序列设计合成PCR引物，有义链引物：5’ATG GCT GCC ATG TCA GAA GAC TC3’反义链引物：5’CTA ACT TTG ATG TAA GTT AGT G3’。以从小鼠脾细胞中提取的mRNA为逆转录模板，采用RT-PCR法扩增获得mIL-18全长cDNA，经酶切鉴定和序列分析证实所克隆的基因序列与Gene Bank中登录的序列完全一致，为下一步的实验奠定了基础。1.2 重组质粒的构建和鉴定本实验利用基因工程技术构建了pCMV-IL18、pCMV-B7.1单基因表达重组质粒和pCMV-IL18-B7.1双基因共表达重组质粒。同时利用吴丛梅博士克隆的Egr-1启动子构建包含 mIL-18、mB7-1基因的辐射诱导表达质粒，分别构建了pEgr-IL18、pEgr-B7.1单基因表达重组质粒和pEgr-IL18-B7.1双基因共表达重组质粒, 并检测其经电离辐射诱导后于体外和体内的表达。2. 重组质粒的转染及稳定转染细胞的筛选质粒转染细胞采用脂质体包裹法，pEgr-IL18-B7.1转染后经48~72h，待细胞生长接近融合时按1:4密度传代。继续培养至细胞密度达50%~70%融合，更换含一定浓度G418的培养液进行筛选，约10~20d后，可见有抗性克隆形成，扩大培养即为<WP=94>稳定表达细胞。3．重组质粒辐射诱导表达增强特性3.1 不同剂量X射线照射后IL-18和B7.1 mRNA水平的表达用脂质体转染法将重组质粒转染至恶性黑色素瘤细胞B16中，转染后24h接受0Gy、0.1Gy、0.5Gy、2.0Gy和5.0Gy不同剂量X射线照射。照射后12小时收集细胞，提取总RNA，以GAPDH（引物竞争PCR）为内参照经RT-PCR半定量检测，结果发现pEgr-IL18、pEgr-B7.1和pEgr-IL18-B7.1重组质粒转染B16细胞后经不同剂量X射线照射，照射组IL-18和B7-1 mRNA表达均明显增高, 其表达量随着照射剂量的增高而增高，很低剂量X射线照射（如0.1 Gy）也能诱导IL-18 mRNA的表达，未转染组没有观察到IL-18 mRNA的表达。3.2 不同剂量X射线照射后IL-18和B7.1 蛋白水平的表达分别转染pEgr-IL18、pEgr-B7.1和pEgr-IL18-B7.1重组质粒后24 h进行照射，分别经0.1 Gy、0.5 Gy、2.0 Gy、5.0 Gy X射线照射后12 h收集细胞上清，经ELISA检测发现，重组质粒转染的B16细胞经不同剂量X射线照射，照射组mIL-18表达均比未照组明显增高，并且其表达量随照射剂量增高而增高。由于Egr-1为血清刺激因子，因此在含血清的培养基中有基础表达。照射后12 h收集细胞，利用流式细胞仪检测细胞表面B7-1表达发现，B7-1表达量也随照射剂量增高而增高。3.3 2.0 Gy X射线照射后不同时间IL-18和B7.1 蛋白水平的表达分别转染重组质粒后24 h照射，经2.0 Gy X射线照射后3、6、12、24、48 h分别收集细胞上清，经ELISA检测，转染质粒的B16在受照射后6 h开始IL-18分泌量明显增高，随着时间其表达量逐渐增高，48h小时达峰值。分别转染pEgr-B7.1和pEgr-IL18-B7.1重组质粒后24 h照射，经2.0 Gy X射线照射后1、3、6、12、24、48 h收集细胞，经流式细胞仪检测发现，B16细胞转染重组质粒后经2Gy X射线照射，照射组细胞表面B7.1表达均比未照组明显增高（p<0.01）,在照后3 h开始细胞表面B7.1表达增高，随着时间其表达量逐渐增高，48h小时达峰值。4．重组质粒联合X射线照射对B16黑色素瘤的生长抑制作用本研究采用脂质体包裹质粒DNA的方法治疗恶性黑色素瘤荷瘤C57BL/6J小鼠。待肿瘤体积达100 mm3左右时注射重组质粒，注射后第1、3、5天分别给予5Gy X射线照射，治疗开始第6天（治疗结束第1天）开始5Gy单纯放疗组和基因联合5Gy放疗组的肿瘤生长明显比对照组缓慢；第14天单纯对照组肿瘤体积达到4369.95mm3，而单纯放疗组和pEgr-IL18、pEgr-B7.1、pEgr-IL18-B7.1基因联合放疗组肿瘤体积分别只有2530.63 mm3和1780.60、1619.00、813.08 mm3，单基因联合放疗组的肿瘤生长速度明显低于对照组和单纯放疗组（p<0.05），体积分别只有单纯对照组的40.75%、37.52%。双基因联合放疗组的疗效最好，体积只有单纯对照组的18.61%。治疗开始第10天（治疗结束第5天）