[目的]：　　金黄色葡萄球菌和鲍曼不动杆菌分别是临床常见的致病菌和条件致病菌。近年来，由于抗生素的不合理使用，使临床常见病原菌的耐药性日趋严重，给临床治疗造成极大的困难。另外，由于可移动DNA元件的存在，使得细菌的耐药性传播更加严重。因此，比较系统、全面地研究耐药性相关基因的多样性、遗传变异规律及基因水平转移的分子机理显得尤为重要。本课题研究了氨基糖苷类耐药基因在临床分离的病原菌的分布及其丰度，尤其研究了金黄色葡萄球菌和鲍曼不动杆菌特有的若干种氨基糖苷类耐药基因的多样性及其功能，为揭示耐药性播散的分子机理打下基础。　　[方法]：　　收集耐药性基因数据库(ARDB)、其它蛋白质序列数据库（如Uni-Pro）和核酸序列数据库（如GenBank）等中的与氨基糖苷类抗性酶基因相关的序列，经聚类分析后，提取一致性序列为氨基糖苷类耐药基因的参考序列。以温州医科大学附属第一医院临床得到金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、屎肠球菌和粪肠球菌各约200菌株作为实验菌株，采用碱裂解法提取基因组DNA，并经电泳实验证实，再将全部DNA送交深圳华大基因研究院进行solexa测序。利用生物信息学方法对测序结果进行拼接、注释和比较基因组学分析，分析氨基糖苷类基因的种类及其在不同种属细菌中的分布。选择金黄色葡萄球菌和鲍曼不动杆菌特有的氨基糖苷类耐药基因(aadC、 aadD、aac(6')-Iv)，设计PCR引物，进行携带目的基因单个菌株的筛选，进而克隆目的基因，并对目的基因进行耐药谱和耐药性测定。　　[结果]：　　1.我们从数据库中收集到氨基糖苷类耐药基因型及其亚型序列151条，以它们为为参考序列，对测序读长进行mapping，结果发现在金黄色葡萄球菌混合基因组测序序列中，mapping到30条氨基糖苷类耐药性相关基因;在鲍曼不动杆菌混合基因组测序序列中mapping到29条基因。　　2.比较8种属细菌样本（鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯菌、屎肠球菌、金黄色葡球、铜绿假单胞菌、阴沟肠杆菌）混合基因组测序结果，发现aadC和aadD只在金黄色葡萄球菌混合基因组测序序列中存在，而aac(6')-Iv基因只在鲍曼不动杆菌混合基因组测序序列中存在。　　3.将aadC、 aadD和aac(6')-Iv基因设计引物，分别对233株金黄色葡萄球菌和200株鲍曼不动杆菌进行相应基因筛选，结果筛选到aadC基因阳性金黄色葡萄球菌2株，aadD阳性金黄色葡萄球菌5株，aac(6')-Iv基因阳性鲍曼不动杆菌4株。　　4.对aadC、 aadD和aac(6')-Iv基因进行克隆和MIC测定，结果发现，aadC、aadD和aac(6'）-Iv基因的部分重组菌(pET32a∷aadC(SA35)/JM109、pET32a∷aadC(SA141)/JM109、pET32a∷ aadD(SA35)/JM109、pET32a∷aadD(SA37)/JM109、pET32a∷aadD(SA39)/JM109、pET32a∷aadD(SA52)/JM109、pET32a∷aadD(SA94)/JM109、pET15b∷aac(6')-Iv(AB181)/JM109、pET15b∷aac(6')-Iv(AB182)/JM109与对照菌株(pET32a/JM109、pET15b/JM109)比较，对多种氨基糖苷类抗生素（如妥布霉素、大观霉素、新霉素、西索米星、小诺米星、核糖霉素）的耐药性有明显提高（提高2个稀释度以上，最多的大7个稀释度）。　　[结论]：首先，在方法学上表明高通量测序技术非常适合用来筛选多重耐药细菌的耐药基因是非常有效的方法，在没有精确参照序列的情况下，同样也可以检测和发现实验样本中存在的基因型。其次，aadC和aadD两个基因只出现在金黄色葡萄球菌中，而aac(6')-Iv只出现在鲍曼不动杆菌中。