研究背景与目的：恶性肿瘤已发展成人类健康的第一杀手。对于肿瘤的治疗传统上可采用化疗、放疗与手术三种方式,但化疗与放疗存在严重的毒副作用,手术难以完全切除肿瘤组织,传统疗法在肿瘤的治疗中遇到了瓶颈。随着对肿瘤发生发展的机理及机体免疫系统的进一步认识,肿瘤免疫疗法迅速地发展成为肿瘤的第四种治疗方法。由于具有良好的靶向性,毒副作用小,能提高患者的生存质量和生存期,受到医生和患者的欢迎。在肿瘤免疫治疗中,EGFR (epidermal growth factoraecepto r,表皮生长因子受体)是一个最热门的靶标。它是一种具有酪氨酸激酶活性的生长因子受体,常过表达于肿瘤细胞的表面,与肿瘤的细胞增殖、迁移、侵袭、血管生成、抗凋亡等密切相关。目前针对EGFR的治疗药物主要包括两类,一类是单克隆抗体,与配体竞争性地结合EGFR胞外区配体结合域,阻碍生长因子信号的转导；另一类是小分子酪氨酸酶抑制剂,靶向胞内酪氨酸激酶域ATP结合位点,阻碍信号的活化。这两类药物在临床上均取得了一定的成功,但总体治疗效果较差。究其原因,一是靶向EGFR胞外区配体结合域的单抗,在与EGF、TGF等配体竞争性结合中处于劣势,难以竞争过小分子配体；二是病人的遗传背景存在差异；三是目前的靶向部位无论是胞外区的还是胞内区的均易发生变异。这些原因使得靶向EGFR的药物在临床上只有10-25%的反应率。在EGFR信号传导中,EGFR与配体结合后,便与另一分子的EGFR或EGFR家族其他成员分子进行同源或异源二聚化,进而激活胞内的酪氨酸激酶活性,将信号传递到胞内。EGFR二聚化是EGFR信号活化的关键事件,靶向EGFR二聚化界面这一进化上保守的区域来阻止EGFR信号的传导,理论上能更好地阻断信号通路,从而更有效地抑制肿瘤细胞的生长。类似假设已在EGFR家族第2个成员HER2上得到验证。靶向策略既可采用单抗的被动免疫治疗,也可采用肿瘤疫苗类的主动免疫治疗。但单抗治疗时由于单抗的体内半衰期短,需要连续多次给药,用药量大,治疗费用高,还存在着心脏毒副作用。肿瘤多肽疫苗作为肿瘤疫苗的一种,制备简单,仅需数次少量给药,便可在体内产生相应单抗的免疫反应,且具有免疫记忆性,没有心脏毒副作用,因此具有良好的发展前景。但多肽分子量小,免疫原性弱,需要借助载体蛋白的作用增强其免疫效果。P64k是一种来自脑膜炎奈瑟氏球菌的外膜蛋白,具有良好的免疫增强作用。用它作为载体蛋白制作的肿瘤多肽疫苗CIMAvax EGF已在古巴、秘鲁等国上市,用于治疗晚期非小细胞肺癌。中药茯苓多糖可调节机体的免疫功能,抑制肿瘤的生长,有可能增强肿瘤多肽疫苗的抑瘤效果。本研究将在EGFR二聚化界面B细胞表位(EGFRBCE)多肽疫苗的基础上,利用基因工程技术,以P64k蛋白为载体蛋白,构建出三种不同形式的靶向EGFR二聚化界面的多肽疫苗,通过动物体内实验筛选出最佳的构建形式,再联合应用中药茯苓多糖的免疫调节作用,来探索能否增强肿瘤多肽疫苗的抑瘤效果,为EGFR异常的肿瘤的治疗探索新的疗法。方法与结果：1肿瘤多肽疫苗P64k-EGFRBCE融合蛋白融合位点的生物信息学筛选为了便于B细胞表位与免疫细胞及免疫分子相互作用,在将表位与载体蛋白相融合时,需要选择合适的融合位点,以确保表位不被载体蛋白所遮掩。由于抗原的B细胞线性表位往往呈现暴露状态,位于抗原分子的表面,可以考虑将肿瘤的抗原表位融合在载体蛋白P64k的抗原表位上,以利于肿瘤抗原表位的暴露与提呈。采用B细胞表位在线预测工具、蛋白质二级结构预测工具、蛋白质高级结构显示软件,对载体蛋白P64k的B细胞表位进行预测。选取三个经三种预测共同确认的B细胞表位,作为与EGFRBCE融合的位点。这三个位点分别是P64k的N端、C端、第379位氨基酸处。用二级结构预测工具对融合后的序列进行分析,在此三处分别连接上EGFRBCE后,载体蛋白和EGFRBcE的结构均未受到大的影响,EGFRBCE表位的特性未发生改变。2肿瘤多肽疫苗P64k-EGFRBCE融合蛋白的构建和纯化采用重叠延伸PCR(splicing overlapping-expand PCR,SOE-PCR)技术分别构建肿瘤多肽疫苗P64k-EGFRBCE融合蛋白三种构建形式的融合基因,即N端融合基因P64k-EGFRBCE-N基因,C端融合基因P64k-EGFRBCE-C基因,第379位氨基酸融合基因P64k-EGFRBCE-379基因。将融合基因分别与pMD18-T载体连接后,进行测序验证。之后再分别克隆至pET21-b表达载体,转化入大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)中,进行IPTG诱导表达。根据融合蛋白的分子特性,采用Q阴离子交换层析和镍离子金属亲和层析进行纯化。利用SOE-PCR 技术分别扩增了肿瘤多肽疫苗P64k-EGFRBCE融合蛋白三种构建形式的融合基因,与pMD18-T载体连接后,测序验证序列均正确。构建至pET21-b表达载体,转化入大肠杆菌BL21(DE3)表达宿主,在IPTG的诱导下,三种构建形式的融合蛋白均获得了表达,SDS-PAGE分析显示分子量大小与预期的70kD一致。其中,融合蛋白P64k-EGFRBCE-C主要以可溶形式存在,融合蛋白P64k-EGFRBCE-N、P64k-EGFRBCE-379主要以包涵体形式存在。经过Q阴离子交换层析和镍离子金属亲和层析纯化后,分别制得了三种纯度均在95%以上的P64k-EGFRBCE融合蛋白,为体内实验提供了材料。3肿瘤多肽疫苗P64k-EGFRBCE不同构建形式融合蛋白的免疫原性及体内抑瘤活性的比较将三种肿瘤多肽疫苗P64k-EGFRBCE融合蛋白与Freund ’s佐剂乳化后免疫C57BL/6小鼠,每只小鼠每次免疫融合蛋白100μg,前后共免疫3次。每次免疫后的一周剪尾取血,采用ELISA测血清抗体滴度。三种构建形式的多肽疫苗第一次免疫后血清中抗EGFRBCE抗体的滴度均不高。第二次和第三次加强免疫后,抗肽抗体的滴度大幅度升高,疫苗P 64k-EGFRBCE-N及P64k-EGFRBCE-379第二次免疫后的抗体滴度达到了2000, P64k-EGFRBCE-C的抗体滴度达到了4000,第三次免疫后疫苗P64k-EGFRBCE-N 及 P64k-EGFRBCE-379的抗肽抗体滴度达到8000,而P64k-EGFRBCE-C的抗体滴度达到16000以上,此结果表明C端融合的多肽疫苗具有更强的免疫原性。在第三次免疫后的第10天,给各组C57BL/6小鼠体内移植1mm3大小的小鼠Lewis肺癌肿瘤组织块,14天后处死小鼠,剥离肿瘤组织称重,以佐剂免疫组小鼠肿瘤作为阴性对照,计算抑瘤率。接种肿瘤后,小鼠成瘤率100%。三种疫苗免疫组小鼠的肿瘤均小于对照组小鼠肿瘤,具有统计学差异,表明靶向EGFR二聚化界面的肿瘤多肽疫苗能够抑制小鼠Lewis肺癌的生长。以免疫佐剂组为对照,三种疫苗免疫组P64k-EGFRBCE-C、P64k-EGFRBCE-N、P64k-EGFRBCE-379的抑瘤率分别为34.4%、29.4%、27.1%, P64k-EGFRBCE-C疫苗免疫组的抑瘤率稍高于后两组,但差异没有显著性。由于融合蛋白P64k-EGFRBCE-C在表达时主要以可溶形式存在,便于生产与纯化,可将之作为靶向EGFRBCE的肿瘤多肽疫苗的最佳构建形式,用于后续的研究。4 中药茯苓多糖对肿瘤多肽疫苗的增强作用将C57BL/6小鼠分为免疫佐剂组、肿瘤多肽疫苗免疫组、中药茯苓多糖组、肿瘤多肽疫苗免疫联合中药茯苓多糖组,所接种的疫苗为筛选出的最佳构建形式P64k-EGFRBCE-C,接种次数为3次,接种量为100μg。通过抗体滴度检测和肿瘤抑制率来考察中药茯苓多糖对肿瘤多肽疫苗的作用。抗体检测结果显示,中药茯苓多糖组的抗体滴度三次均为0,而肿瘤多肽疫苗组三次的抗体滴度分别为2000,4000,16000,多肽疫苗免疫联合茯苓多糖灌胃组小鼠的三次抗体滴度分别为4000,16000,64000,联合组的抗体滴度高于疫苗单独作用组。对Lewis肺癌的抑制率,以免疫佐剂组为阴性对照,多肽疫苗组的抑瘤率为30.8%,茯苓多糖组的抑制率为13.4%,疫苗与多糖联合组的抑瘤率为53.8%,联合组与疫苗单独作用组相比,肿瘤抑制率具有显著性差异。茯苓多糖灌胃组及联合作用组小鼠的胸腺指数、脾脏指数升高,提示茯苓多糖增强了C57小鼠的免疫能力,从而提高了抗肽抗体的滴度,并增强了对肿瘤的抑制效果。结论：本研究在EGFR二聚化界面B细胞表位肽研究的基础上,利用生物信息学和基因工程技术构建了三种靶向EGFR二聚化界面的B细胞表位肽疫苗。利用层析纯化技术获得了95%以上纯度的重组肽,在C57小鼠体内筛选出了重组肽的最佳构建形式为C端融合,即P64k-EGFRBCE-C。三次免疫后的小鼠血清抗肽抗体滴度可达16000以上,肿瘤抑制率可达34.4%。与中药茯苓多糖联用后,肿瘤疫苗的抗肽抗体滴度达64000以上,肿瘤抑制率达到了53.8%,茯苓多糖可增强靶向EGFR二聚化界面的肿瘤多肽疫苗的抑瘤效果。本研究成功构建了靶向EGFR二聚化界面的肿瘤多肽疫苗,与中药茯苓多糖联合应用后,改善了机体的免疫状态,增强了疫苗的抑瘤效果。本研究为EGFR异常表达肿瘤的治疗性多肽疫苗研究和临床应用奠定了基础。