【摘 要】
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DNA元件百科全书（Encyclopedia of DNA Elements,ENCODE）联盟通过对人类基因组的深入研究,预测80%的人类基因组有一定的生化功能,而编码蛋白质的基因只占据其中的不到2%,其余大部分为非编码区域。长链非编码RNA（long noncodingRNA,lncRNA）近年来获得许多的研究关注,利用反向遗传学研究手段对lncRNA进行敲除或敲低是其功能研究中重要的环节。现
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DNA元件百科全书（Encyclopedia of DNA Elements,ENCODE）联盟通过对人类基因组的深入研究,预测80%的人类基因组有一定的生化功能,而编码蛋白质的基因只占据其中的不到2%,其余大部分为非编码区域。长链非编码RNA（long noncodingRNA,lncRNA）近年来获得许多的研究关注,利用反向遗传学研究手段对lncRNA进行敲除或敲低是其功能研究中重要的环节。现有的技术手段对于lncRNA功能研究均具有不同程度的局限性或挑战性,而构建稳定的lncRNA敲低系统对其功能研究至关重要。近年来发现的CRISPR/Cas系统因其高特异性的优点迅速地被发展为研究基因组和转录组的有效工具。其中CRISPR/CasRx由于其效应蛋白较小,低脱靶效应、高特异性以及高敲低效率使之有成为高效的RNA干扰工具的潜力。人慢性髓性白血病细胞系K562是一种悬浮细胞,是lncRNA功能研究中广泛使用的一类细胞系,然而与贴壁细胞相比,其转染困难,因而对其中的RNA进行有效敲低较为困难。因此,本课题将基于CRISPR/CasRx在K562细胞系中建立lncRNA敲低体系。首先,针对靶标lncRNA设计一系列gRNA,在HEK 293FT细胞引入CRISPR/CasRx系统,筛选出对靶标RNA具有较高敲低效率的gRNA。其次,在K562细胞系中构建可通过流式分选系统筛选出Cas Rx和gRNA慢病毒载体感染的阳性细胞的CRISPR/CasRx体系。最后,通过条件优化在K562细胞中进行lncRNA的敲低,并进行敲低效果鉴定。本研究通过引入流式分选系统筛选出被慢病毒感染的阳性细胞,解决了K562细胞转染效率的瓶颈,在K562细胞中实现了lncRNA的有效敲低,该方法的建立将为同类细胞中的lncRNA的研究奠定基础。
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