恶性肿瘤严重威胁着人类的生命和健康,其中肝癌是全球最常见的恶性肿瘤之一。我国乙肝患者众多,是全球肝癌发病率最高的国家。肝癌因其高发生率、高死亡率、诊断困难、极易复发等而成为“癌中之王”。最新统计显示,我国肝癌发病人数占全球的55%,死亡人数占全球的45%,因而肝癌的治疗研究迫在眉睫。肿瘤包括肝癌是由于基因紊乱所引起的疾病,因此基因治疗被普遍认为是人类攻克癌症的希望。尤其是靶向基因治疗的研究更具有重要意义。在基因治疗中,载体的选择是关键所在。目前病毒载体由于其具有转染率高、基因持续表达时间长等优点而成为肿瘤的基因治疗的载体首选。肿瘤特异性增殖腺病毒(即溶瘤腺病毒),是目前最具前景的靶向基因治疗载体之一。腺病毒复制最重要的元件是E1区,我们用肝癌特异性启动子alpha-fetoprotein promoter(AFP)代替E1A本身的启动子,构成Ad-enAFP- E1A。E1B区主要由55kDa和19kDa组成。55kDa的缺失可以靶向P53突变的肿瘤细胞,并能选择性抑制病毒mRNA出核。19 kDa是Bcl-2的同系物,在最近的研究报道中E1B 19 kDa的缺失能够通过多途径诱导肿瘤细胞凋亡,并且可能具有增强病毒传播能力的作用,因此,同时删除E1B区55kDa和19kDa,不仅可以增强病毒的靶向性,而且可以大大提高病毒的促凋亡能力,是一种新的改造溶瘤腺病毒的方法。上述构建物简写为Ad.enAFP-E1A-△E1B,即为具有肝癌特异性的三靶向溶瘤腺病毒载体,此腺病毒只能靶向肝癌细胞并具高的安全性和杀伤性。刘新垣院士于2001年提出了癌症的靶向基因-病毒治疗(Targeting Gene-Virotherapy)的概念,之后又提出了双靶向基因-病毒治疗(Dual Targeting Gene-Virotherapy)等策略。该策略中,一个靶向性的病毒载体需要携带一个好的肿瘤治疗基因,利用溶瘤病毒在肿瘤细胞内特异性裂解、增殖和肿瘤治疗基因对癌细胞的强烈促凋亡作用或抑制作用“协同作战”,因而达到病毒在肿瘤内特异性增殖和治疗基因协同杀伤肿瘤的双重作用。在本课题研究中,选择黑色素瘤分化相关基因-7/白介素-24 (mda-7/IL-24)基因作为新构建的病毒载体所携带的肿瘤治疗基因。IL-24是一个具多功能调节并诱导癌症细胞凋亡的细胞因子,由于它对肿瘤杀伤效果显著,且具有选择性高、对正常细胞无毒害等特点,IL-24基因成为于肿瘤基因治疗中的“明星”,被广泛应用于肿瘤的基因治疗。本研究中,IL-24插入我们构建的肝癌特异性双靶向溶瘤腺病毒载体Ad.enAFP-E1A-_△E1B中,重组成基因-病毒Ad.enAFP-E1A-_△E1B-IL-24。体外实验表明Ad.enAFP-E1A-_△E1B-IL-24能诱导肝肿瘤细胞死亡,表现很强的肿瘤杀伤能力,而且对正常的肝细胞几乎没有杀伤作用,证明其有效的安全性。肝癌细胞系Huh-7荷瘤裸鼠动物实验证明Ad.enAFP-E1A-_△E1B-IL-24能完全地抑制肿瘤的进一步恶化,并且具有潜在的传播能力,可以杀伤肝癌细胞,提高荷瘤裸鼠的生存率。同时发现Ad.enAFP-E1A-_△E1B-IL-24诱导肿瘤细胞凋亡的机制主要涉及到死亡受体介导的凋亡途径以及线粒体/细胞色素C介导的调亡通路。本课题初步实践了肿瘤的多靶向基因-病毒治疗策略,成功构建了具有肝癌特异性的溶瘤腺病毒载体,为肝癌的临床治疗研究提供了更为安全有效的肿瘤靶向基因—病毒治疗方案,为成功实现肝癌的特异性治疗奠定了坚实的基础。此外,在改造腺病毒的研究中,E1B区的19 kDa的删除不仅促进了肿瘤细胞的凋亡,而且能够增强病毒的传播能力,这些发现对于今后肿瘤的靶向基因-病毒治疗中病毒载体的改造和研究应用都有重要意义,提供了新的思路与方向。