【摘 要】
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目的:间充质干细胞来源外泌体具有组织修复与皮肤再生功能,可以促进表皮细胞的增殖,抑制表皮细胞凋亡,从而促进皮肤组织修复。目前,传统的外泌体鉴定分析主要通过免疫蛋白印迹、透射电镜和纳米追踪分析等技术分析外泌体的特异性标志物、形态学特征、粒径和浓度。但是,目前的鉴定分析方法还存在一些不足之处:纳米跟踪分析技术检测的是样本中所有粒径在30～200 nm的粒子,这些粒子除了外泌体,还可能有脂质或者蛋白质聚
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目的:间充质干细胞来源外泌体具有组织修复与皮肤再生功能,可以促进表皮细胞的增殖,抑制表皮细胞凋亡,从而促进皮肤组织修复。目前,传统的外泌体鉴定分析主要通过免疫蛋白印迹、透射电镜和纳米追踪分析等技术分析外泌体的特异性标志物、形态学特征、粒径和浓度。但是,目前的鉴定分析方法还存在一些不足之处:纳米跟踪分析技术检测的是样本中所有粒径在30～200 nm的粒子,这些粒子除了外泌体,还可能有脂质或者蛋白质聚集体等,无法区别外泌体、脂质和蛋白质聚集体,不能对外泌体进行单独计数,检测出的外泌体浓度往往偏高;免疫蛋白印迹只能鉴定外泌体的特异性标志物,不能准确定量。所以,目前有效鉴定分析外泌体依然是研究者面临的一个难题。基于以上研究背景,本研究对外泌体鉴定分析方法进行优化,同时初步探究人脐带血间充质干细胞来源外泌体优化前后对表皮细胞损伤修复的影响。研究方法:超速离心法提取分离人脐带血间充质干细胞上清液得到外泌体;免疫蛋白印迹鉴定外泌体特异性标志物CD63和CD81;流式细胞术基于磁珠分选外泌体,鉴定分析外泌体特异性标志物CD63和CD81阳性表达量;纳米颗粒追踪分析技术检测外泌体粒径和总粒子数;透射电镜对外泌体的形态学进行表征;水浴热处理诱导表皮细胞损伤;激光扫描共聚焦显微镜观察外泌体在体外被表皮细胞摄取的过程;CCK-8法检测外泌体浓度及鉴定分析优化前后对表皮细胞增殖的影响;流式细胞术检测外泌体浓度及鉴定分析优化前后对表皮细胞凋亡的影响。结果:1.间充质干细胞源外泌体鉴定优化:免疫蛋白印迹法鉴定外泌体特异性标志物CD63、CD81表达阳性;流式细胞术鉴定分析外泌体特异性标志物CD63阳性率为87.9%,CD81阳性率为92.6%;纳米追踪分析技术检测样本粒径143.8 nm,粒子数3.9×1011particles/m L;透射电镜观察所得样本粒径在100 nm左右,形似“茶托状”膜性囊泡,具有外泌体的形态特征;激光共聚焦显微镜观察外泌体能被表皮细胞摄入,1 h开始进入细胞发挥作用。2.间充质干细胞源外泌体对表皮细胞功能的影响:（1）CCK-8检测结果显示,外泌体促进表皮细胞增殖,且5.0×10~8particles/m L外泌体与表皮细胞共培养24 h后,表皮细胞增殖能力最强;（2）与外泌体鉴定分析优化前比较,优化后5.0×10~8particles/m L外泌体对表皮细胞增殖能力更强;流式细胞术结果显示,外泌体抑制表皮细胞凋亡,其中5.0×10~8particles/m L外泌体与损伤表皮细胞共培养24 h后,表皮细胞抗凋亡能力最强;与外泌体鉴定分析优化前比较,5.0×10~8particles/m L优化后外泌体抑制表皮细胞凋亡能力更强。结论:本研究采用基于磁珠分选外泌体的流式细胞术替代免疫蛋白印迹,不仅可以鉴定外泌体特异性标志物CD63、CD81阳性表达,且可检测表达量,弥补纳米追踪技术不能分选外泌体的缺点;间充质干细胞来源外泌体促进表皮细胞增殖,抑制细胞凋亡;鉴定分析优化后的外泌体对表皮细胞增殖和抗凋亡作用更强。
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