膀胱癌是国人泌尿系统最常见的恶性肿瘤，如何预防膀胱肿瘤术后复发、治疗术后残余瘤与原位癌是临床亟待解决的重大问题。研究认为实体瘤的生长与转移离不开肿瘤血管的生成，当肿瘤生长体积超过3mm~3、细胞数达10~7后就必须依赖肿瘤组织中的新生血管形成来提供生长所必须的养分及排出代谢废物。如果肿瘤超过这样的体积还缺乏毛细血管和小血管的生成，肿瘤将发生退化。因此，抑制血管生成可能是抑制肿瘤生长、防止肿瘤转移的一种有效策略。 肿瘤的血管生成是血管生成刺激因子和抑制因子共同作用的结果。目前已分离出多种血管生成刺激因子和抑制因子，最主要的刺激因子有血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子等，主要的抑制因子有内皮抑素、血管抑素及干扰素等。内皮抑素是大分子物质胶原蛋白ⅩⅧ羧基端的20kDa片段，被认为是迄今为止所发现的作用最强的血管生成抑制剂。内皮抑素能有效抑制血管内皮细胞的增殖，促使肿瘤细胞的凋亡，抑制肿瘤的生长和转移，具有很强的抗肿瘤特性，而且无耐药性和毒副作用。因此，内皮抑素将成为肿瘤抗血管生成治疗的首选生物制剂。 目前使用内皮抑素进行生物治疗有两种形式：蛋白质形式的内皮抑素和基因形式的内皮抑素。虽然内皮抑素蛋白抗肿瘤血管生成作用显著，但是也出现了三个不容忽视的问题：1．蛋白纯化过程可能破坏内皮抑素的天然属性导致产量降低或蛋白活性减弱；2．内皮抑素作为一个蛋白药物，在体内的半衰期很短，在血清中难以保持能起治疗作用的浓度；3．如何把内皮抑素蛋白源源不断地输送到患者体内存在实际的操作性困难。因此，解决上述问题的一个可能的方法就是基因治疗，即把内皮抑素基因转移入细胞内，使细胞不断表达和分泌内皮抑素，从而起到治疗作用。 天津医科大学博d匕学位论文 内皮抑素的基因治疗应用了不同的载体系统，如用质粒直接注射肌肉，脂质体介导转染，应用病毒载体进行基因转移等，这些方法各自取得了一定的效果。腺相关病毒属于微小病毒科，是一种缺陷病毒，而且是唯一一种以位点特异性方式整合在人19号染色体上的真核病毒，从而避免了随机整合而导致宿主细胞突变的潜在危险性。重组腺相关病毒载体在肿瘤血管生成基因治疗中的优越性是多方面的，近年来逐渐成为研究的热点。 同所有实体瘤一样，膀肤癌的浸润生长、转移也呈血管新生依赖性，甚至有人认为微血管密度是患者预后独立的检测指标。因此本实验采用人n型腺相关病毒为基因治疗载体，介导人内皮抑素基因，并在目的基因前方加上一段信号肤序列IgG，利用病毒对膀肤癌细胞天然的感染性，将内皮抑素基因转移入细胞内，使其特异整合在19号染色体上，伴随肿瘤细胞的分裂持续表达内皮抑素并分泌到细胞间质内，发挥抗血管生成作用。 第一部分 基因重组rAAy‘Endostatin的包装 应用基因工程和分子生物学技术构建载体质粒并以质粒共转染方法包装rAA铸Endos枉吐in病毒颗粒: 1.以质粒p1REs一Endo为模板PCR扩增IgG一Endostatin片段，上游引物:GAcatcga护汀GAA户TGCAGCTGGG了口以，C，引入aal位点;下游引物:，几，犯亡C认CTTGGAGGCAGTCATG，引入BamHI位点。pCR产物经测序鉴定无误后以Clal、BamHI双酶切该片段，电泳、胶回收备用;同时以相同的两种限制性内切酶酶切载体质粒pCMV-MCs，胶回收质粒骨架部分，将lgG一Endostatin序列定向克隆入pCMV-MCs，构建质粒pCMV‘IgG-Endostatin。将所构建质粒转化E. coli DHSQ感受态细菌，大量收获质粒后测序鉴定，上游引物:ATTCTGAGTCCAAGCTAGGC，下游引物二TAGAAGGACACCTAGTCAGA，分别位于多克隆位点上游的beta-giobin Intron和下游的hGH pA中，片段长度为1006bp，电泳和测序结果无误，证明质粒pCMV-IgG一Endostatin构建成功。 5 口毛创片医科大学博士学位论文 2.为了避免克隆过程中ITR的丢失，以Notl酶切质粒pCMV-IgG-Endos公妓in和腺相关病毒载体质粒pAAv-MCS，电泳、胶回收pA戌认MCS的原核表达片段及pCMV-lgG一Endostatin的真核表达框，两者连接进行亚克隆，构建质粒pAAv-IgG一Endostatin。将所构建质粒转化E coli DHS。感受态细菌，大量收获质粒后PeR鉴定，上游引物:CeTeTG解竹oAoCoTeG灯，下游引物:TACI沪n，GGTTGCTTTGACGT，分别位于上游的L一ITR和下游的R一ITR内，共3119bp。PCR产物电泳结果正确，证明质粒pAAV-IgG~Endostatin构建成功。 3.培养HEK293细胞，待HEK293细胞长至70一80%融和，取pAAv‘IgG-Endostatin、pRC和PHelPer电转法共转染，包装rAA认Endostatin;电转化72小时后取其冻溶液100川再次转染HEK293细胞，重复两次，收集冻溶液中的第三代重组腺相关病毒，浓缩纯化。电镜检测病毒形态正常，ELISA法测定病毒滴度达一Zxlo，Zv.p/ml。 该课题部分利用基因工程和分子生物学技术构建pCMv-IgG一End0Statin穿梭质粒，为防止克隆过程中IT