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第一部分:红霉素对慢性阻塞性肺疾病外周血单个核细胞糖皮质激素抵抗的研究目的:探讨COPD患者外周血单个核细胞(PBMCs)糖皮质激素抵抗情况以及红霉素干预对其的影响方法:选取健康人、吸烟的健康人、稳定期的COPD患者各8例,分组:(1)正常对照组(2)吸烟组(3)COPD组(4)COPD+红霉素组,每个研究对象抽取外周静脉血20ml,在无菌条件下采用泛影钠-不连续密度梯度离心法分离出外周血单个核细胞体外培养。应用ELISA测定IL-8:COPD+红霉素组先予以红霉素10μg/ml浓度预孵育2h,再与不同浓度的地塞米松(Dex,10-12-10-6M)共孵育2h后,应用肿瘤坏死因子-α(TNF-α,5ng/ml)刺激16h后,收集上清液,采用ELISA测量IL-8的表达,得出浓度-抑制反应曲线并计算出各组地塞米松半数抑制浓度(IC50-Dex),IC50-Dex越高说明细胞对糖皮质激素敏感性越差,糖皮质激素抵抗也就越高。结果:1.健康人与吸烟的健康人的PBMCs的IC50-Dex无明显差异。2.COPD患者IL-8的抑制率显著降低,IC50-Dex显著增高(P<0.05),予以红霉素干预,COPD患者外周血PBMCs IL-8抑制率增高,IC50-Dex显著降低,但仍低于健康人。结论:1.与健康人和吸烟的健康人相比,COPD患者PBMCs存在明显的糖皮质激素抵抗。2.红霉素可以减轻COPD患者PBMC糖皮质激素抵抗。第二部分:红霉素对烟草烟雾暴露下单核细胞糖皮质激素抵抗和转录因子AP-1的影响的实验研究目的:1.探讨烟草烟雾暴露下U937单核细胞糖皮质激素抵抗情况以及红霉素干预对糖皮质激素抵抗的影响。2.探讨红霉素对烟草烟雾暴露下单核细胞AP-1表达的影响。方法:本部分采用U937单核细胞为研究对象,实验分组:(1)正常对照组(2)烟草提取物(CSE)组(3)CSE+红霉素组。1.ELISA法测定IL-8:CSE+红霉素组先予以红霉素10μg/ml浓度预孵育2h后,CSE组与CSE+红霉素组予0.25%CSE共孵育刺激2h,再与不同浓度的地塞米松(Dex,10-12-10-6M)共孵育2h后,应用肿瘤坏死因子-α(TNF-α)刺激16h后,收集上清液,采用ELISA测量IL-8的表达,得出浓度-抑制反应曲线并计算出各组地塞米松半数抑制浓度(IC50-Dex),分析每组的糖皮质激素抵抗情况。2.应用实时荧光定量PCR(RT-PCR)测定C-JUN和C-FOS mRNA的表达:COPD+红霉素组先予以红霉素10μg/ml浓度预孵育2h,然后CSE组及CSE+红霉素组加入0.25%的CSE共孵育8h后,收集细胞提取RNA测定mRNA,分析每组C-JUN和C-FOS mRNA的表达。3.Western Blotting测定C-JUN和C-FOS蛋白的表达:COPD+红霉素组先予以红霉素10μg/ml浓度预孵育2h,然后CSE组及CSE+红霉素组加入0.25%的CSE共孵育8h后,收集细胞提取胞内核蛋白,采用Western Blotting测定C-JUN和C-FOS蛋白的表达。结果:1.单核细胞暴露于烟草烟雾后,IL-8抑制率显著降低,IC50-Dex显著增高(P<0.05),给予红霉素预孵育后,IC50-Dex显著降低,糖皮质激素抵抗减轻。2.单核细胞暴露于烟草烟雾后,C-FOS mRNA和C-JUN mRNA和表达明显增高,红霉素预孵育干预后可以降低C-FOS mRNA和C-JUNmRNA的表达。3.烟草烟雾刺激单核细胞后,C-FOS蛋白表达无改变,而C-JUN蛋白水平表达显著增高。同时红霉素干预对C-FOS的表达无影响,但可以显著降低C-JUN蛋白表达(P<0.05)。结论:1.CSE刺激单核细胞导致糖皮质激素抵抗,红霉素可以减轻烟草烟雾暴露下单核细胞糖皮质激素抵抗。2.CSE刺激单核细胞后转录因子C-FOS mRNA表达增高,但蛋白水平表达无改变,且红霉素对C-FOS蛋白表达无影响。3.CSE刺激单核细胞后,C-JUN的蛋白和mRNA表达增高,红霉素干预可以减少C-JUN蛋白和mRNA的表达。第三部分:红霉素通过下调JNK/C-JUN路径而减轻烟草烟雾暴露下引发的单核细胞糖皮质激素抵抗目的:1.探讨C-JUN在烟草烟雾暴露下单核细胞糖皮质激素抵抗的作用。2.探讨红霉素减轻烟草烟雾暴露下单核细胞糖皮质激素抵抗具体作用路径。方法:1.观察烟草烟雾暴露下U937单核细胞C-JUN的表达对糖皮质激素抵抗的影响,采用SiRNA C-JUN转染技术降低C-JUN在U937单核细胞中的表达,将细胞分为四组:(1)正常对照组(2)烟草提取物(CSE)组(3)SiRNA C-JUN组。(4)CSE+SiRNA C-JUN组。2.观察红霉素对C-JUN上游路径MAPK的影响,将U937细胞分六组:(1)正常对照组(2)CSE组(3)CSE+红霉素组。(4)CSE+JNK抑制剂组(5)CSE+P38MAPK抑制剂组(6)CSE+ERK抑制剂组。采用ELISA法测定IL-8的表达,得出浓度-抑制反应曲线并计算出各组地塞米松半数抑制浓度(IC50-Dex)。RT-PCR测定各组C-JUN、P38MAPK、ERK、JNK mRNA在U937单核细胞中的表达。Western Blotting测定各组C-JUN、P38MAPK、P-P38MAPK、ERK、P-ERK、JNK、P-JNK蛋白表达。分析各组之间的差异。结果:1.SiRNA干扰C-JUN的表达后,U937单核细胞暴露于CSE下IL-8表达降低,且IC50-Dex显著降低,糖皮质激素敏感性明显增高,差异有统计学意义(P<0.05)。2.与CSE组比较,U937细胞予以红霉素、JNK抑制剂、P38MAPK抑制剂、ERK抑制剂预孵育2h后再予以CSE刺激,C-JUN mRNA和蛋白表达显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。3.与CSE组相比,红霉素组、JNK抑制剂、P38MAPK抑制剂、ERK抑制剂干预降低IC50-Dex明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。4.红霉素对P38MAPK、P-P38MAPK及ERK、P-ERK蛋白表达无影响,但红霉素可以显著减少JNK和P-JNK蛋白的表达,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1.SiRNA干扰C-JUN的表达后,香烟烟雾暴露刺激单核细胞糖皮质激素抵抗程度减轻,C-JUN的表达增高在糖皮质激素抵抗起重要作用。2.抑制JNK、P38MAPK、ERK活性可以减少暴露于烟草烟雾下单核细胞C-JUNmRNA和蛋白的表达及减轻糖皮质激素抵抗。3.红霉素可以抑制JNK的表达和活性,推测红霉素是通过抑制JNK的活性而减轻C-JUN的表达,从而减轻糖皮质激素抵抗。