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研究背景情志致病是传统中医病因病机理论的重要组成部分,情志应激是指机体针对外界客观事物和现象的反应,包括精神层面的反应及脏腑的功能活动。我们实验已建立情志应激病毒易感模型和肿瘤易感模型,发现情志应激可促进裸鼠体内皮质酮含量增加,并促进流感发病和肿瘤转移。肿瘤在中医范畴中属于“积”,其易感性与情志关系密切。《黄帝内经》记载过:“若内伤于忧怒,则气上逆,而积皆成矣”。卵巢肿瘤的发病原因主要是气滞和冷凝等有形之邪凝聚于下腹胞宫,日久化生积。卵巢肿瘤死亡率高居妇科肿瘤之首,且发病率逐年上升,严重威胁女性的健康。流行病学调查发现,工作压力和不良情绪可促进卵巢肿瘤转移。现代医学模式与古代中医理论认为情志因素在诱发肿瘤中发挥重要作用达成了共识。情志应激刺激下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA）释放多种应激激素,共同构成了心理-神经内分泌调节系统,其中释放的糖皮质激素可激活糖皮质激素受体GR。已有研究初步报道GR表达与卵巢肿瘤患者的PFS负相关,但是GR如何参与卵巢肿瘤侵袭和迁移并未见明确报道。因此,探讨心理应激-神经内分泌对卵巢肿瘤转移的调控作用及其分子机制,有益于阐明卵巢肿瘤转移的病理机制,有望为探索卵巢肿瘤的转移和复发治疗策略提供依据。研究目的:采用情志应激负荷建立裸鼠卵巢肿瘤转移模型,结合临床卵巢肿瘤样本、病理特征分析和体外细胞模型,研究情志应激促进卵巢肿瘤转移的机制,为探索抗卵巢肿瘤转移的治疗新靶点,寻找防治卵巢肿瘤复发和转移的新策略提供必要的理论基础和实验依据。研究方法:体内实验:以拘束负荷和应激激素Corticosterone负荷模拟情志应激建立瘤裸鼠肿瘤转移模型。首先,采用活体成像系统观察裸鼠体内转移的肿瘤和内脏器官转移灶的定植情况,并采用HE染色法检测肝脏内转移灶病理形态。其次,采用ELISA方法检测血清Corticosterone和CA125含量,IHC法检测肿瘤组织目的蛋白的表达。临床数据分析:首先,从临床收集卵巢肿瘤、子宫内膜异位导致的卵巢囊肿及正常卵巢组织3类样本,采用核磁共振技术MRI进行形态学检测;其次,通过IHC检测临床卵巢样本中糖皮质激素受体GR和核蛋白1（Nuclear Protein 1,NUPR1）的表达情况,并利用SPSS软件对卵巢肿瘤组织中表达的GR和NUPR1与临床病理特征之间的相关性进行统计分析;再次,Oncomine database分析NUPR1在卵巢肿瘤与正常卵巢的mRNA水平表达差异情况;然后,cBio Portal database分析GR（NR3C1）与NUPR1及下游调节基因Slug（SNAI2）在临床样本中mRNA水平表达的相关性,最后,Kaplan Meier-plotter database分析NR3C1和NUPR1mRNA水平表达与PFS的相关性。体外实验:首先,在SKOV3和HO8910肿瘤细胞株中利用皮质醇（cortisol,CORT）建立卵巢肿瘤细胞迁移和侵袭体外模型,采用划痕和Transwell实验方法检测CORT对细胞迁移和侵袭能力的影响;其次,利用表达谱芯片技术分析差异基因和IPA软件预测其上游调节基因为NUPR1;最后,采用IF、WB和基因沉默等技术在细胞模型检测GR/NUPR1之间的调控关系及NUPR1对Slug蛋白的调节作用。研究结果:1情志应激激活GR促进卵巢肿瘤转移。拘束负荷组（Str组）小鼠均出现明显的肝脏和肠道转移,66.7%只出现明显的胃部转移灶,33.3%出现脾脏转移灶。Corticosterone负荷组均出现肠道转移,66.7%出现胃部转移和肝脏转移。拘束负荷后给予Corticosterone受体抑制剂（Str+Int（GR））组均出现了肠道转移,66.7%出现胃部转移,但未见明显的肝脏、脾脏和肾脏的转移。Str组血清Corticosterone和CA125的含量均高于对照组（P<0.001）。Str+Int（GR）组血清中CA125的含量低于Str组（P<0.001）。临床IHC结果显示,正常卵巢组织中GR的评分≤6,呈现低表达;卵巢肿瘤组织中GR高表达占64%;子宫内膜异位卵巢囊肿组织中GR高表达占37%。One-way ANOVA统计分析显示,GR在卵巢肿瘤组织中的表达显著高于非卵巢肿瘤组织中的表达（P<0.05）。Kaplan-Meier统计分析显示,卵巢肿瘤组织中的GR表达与FIGO分期存在排他性显著相关（P<0.05）。2激活GR诱导卵巢肿瘤细胞发生转移的机制。CORT激活GR促进细胞骨架蛋白Actin从细胞膜转移至细胞质,进而增加细胞的侵袭和转移能力,Int（GR）可抑制这种作用。谱芯片分析CORT处理组与对照组细胞中差异的基因,发现上皮间充质转化（EMT）转录因子SNAI2基因表达显著上调。IPA软件预测激活GR诱导细胞侵袭和转移能力增加可能是由上游NUPR1基因调控的。通过Oncomine database对185例卵巢肿瘤组织和10例正常卵巢上皮组织的测序结果进行分析,结果显示,卵巢肿瘤组织内NUPR1的表达量是正常卵巢上皮组织表达量的1.7倍,差异显著（P<0.001）;我们收集的临床样本IHC检测结果同样也显示,正常卵巢组织中NUPR1的评分≤6,呈现低表达;卵巢肿瘤组织中NUPR1高表达占59%;子宫内膜异位卵巢囊肿组织中NUPR1高表达占33%。One-way ANOVA统计分析显示,NUPR1在卵巢肿瘤组织中的表达显著高于非卵巢肿瘤组织中的表达（P<0.05）,且Logistic统计分析显示NUPR1与GR表达存在排他性显著正相关（P<0.001）。Kaplan Meier-plotter database分析NR3C1和NUPR1mRNA水平表达与PFS的负相关。3 GR/NUPR1信号通路在卵巢肿瘤转移中的作用。CORT促进细胞内NUPR1mRNA水平表达增加（P<0.001）,并且Si RNA-NR3C1可逆转CORT引起的NUPR1/Slug蛋白高表达和E-cadherin蛋白低表达（P<0.001,P<0.001和P<0.05）。同时,CORT也能降低knockdown NUPR1细胞的侵袭能力（P<0.001）。knockdown NUPR1细胞,Slug蛋白表达较正常组显著减少（P<0.001）,然而E-Cadherin蛋白表达较正常组显著增加（P<0.001）。cBio Portal database对1766例卵巢肿瘤患者肿瘤组织的分析结果显示,患者肿瘤组织GR（NR3C1）、NUPR1和Slug（SNAI2）的异常扩增和突变呈现排他性相关趋势。研究结论:1情志应激通过激活GR促进裸鼠腹腔内卵巢肿瘤转移,GR在临床卵巢肿瘤组织中的表达高于非卵巢肿瘤组织,且卵巢肿瘤组织中GR表达与患者FIGO分期存在排他性显著相关。情志应激增加卵巢肿瘤转移可能与情志应激产生过量皮质激素激活GR有关。2体外实验证实激活GR促进卵巢肿瘤细胞侵袭和转移可能是通过NUPR1基因调节相关蛋白的表达;临床卵巢肿瘤组织中NUPR1与GR表达具有排他性显著正相关,NR3C1和NUPR1mRNA水平表达与PFS负相关。因此,卵巢肿瘤的转移可能与GR调节NUPR1的表达相关。3本课题研究情志应激促进卵巢肿瘤转移的机制,阐明情志应激诱导GR/NUPR1信号通路调节SNAI2促进卵巢肿瘤细胞发生EMT。从心理-神经内分泌方面揭示情志应激对卵巢肿瘤转移的调节作用,为阐明社会心理作为影响卵巢肿瘤转移的重要因素提供必要的理论基础和实验依据。