骨的生长、发育及内稳态依赖于成骨细胞的骨形成与破骨细胞的骨吸收之间平衡。成骨细胞的主要功能是在骨形成及骨折愈合过程合成分泌大量细胞外基质。众所周知，高剂量辐照对骨组织常具有不良影响，包括放射性骨坏死、骨硬化、骨折及骨矿丢失。然而，低剂量电离辐射对骨组织的生物学效应及分子机制目前仍缺乏相关研究。骨科病人更经常接受到电离辐射，如X线摄影、计算机断层扫描或术中透视，辐射暴露通常为低剂量水平。我们课题组前期研究表明，低剂量X线照射促进大鼠骨折模型愈合过程骨痂的矿化，同时不同水平的低剂量X线在体外对成骨细胞的增殖和分化具有不同影响。但是，目前对于低剂量X线对骨组织刺激兴奋效应的潜在机制仍不清楚。在本研究中，我们进一步探讨低剂量X线辐照对成骨细胞增殖、分化及骨折愈合的影响特征，并在此基础上对相关信号通路的调控作用深入研究，以阐述低剂量X线对骨组织刺激兴奋效应的分子机制，为更好的理解低剂量X线对骨组织的生物学效应提供一定理论基础。一、0.5Gy X线照射促进成骨细胞增殖、分化及骨折愈合电离辐射对成骨细胞的影响目前仍存很大争议，且具体分子机制仍不是很清楚。为了进一步研究不同剂量X线对成骨细胞的影响，本部分研究分别应用0.5Gy和5GyX线照射成骨细胞和骨折模型。通过CCK-8，Brdu掺入实验及Sub-G1实验研究对成骨细胞增殖的影响，同时应用Real-time PCR及Western-blot检查骨分化相关基因的表达情况。组织学检查评估骨痂的形成及改建过程。结果显示0.5Gy X线明显促进成骨细胞增殖、分化及骨折愈合。具体表现为，0.5Gy X线增加MC3T3-E1细胞活性及DNA合成，而5GyX线明显抑制细胞活性及增殖，增加细胞的凋亡。Western-blot检测显示MC3T3-E1细胞在电离辐照后骨分化相关标志物蛋白表达水平发生动态变化，包括Col1、ALP、OCN、Runx2、Osterix。在大鼠股骨闭合骨折模型中，0.5GyX线能促进骨折愈合过程，骨痂中PCNA阳性细胞数量、软骨形成及骨痂面积比对照组明显增加，膜内成骨及软骨内成骨进程加速，同时骨形成标志基因Col1α1、Col2α、ALP、OCN、Runx2、Osterix的mRNA表达水平增高。虽然在5Gy照射组骨痂组织中一些骨形成标志物基因的表达也有增高，但是骨痂形成及骨折愈合时间较对照组及0.5Gy组明显延迟，可观察到胶原纤维老化。因此，低剂量的X线照射对成骨细胞具有一定刺激兴奋效应，可增加成骨细胞的增殖、分化及骨折愈合。二、低剂量X线照射对MC3T3-E1细胞基因表达谱的影响为了探讨低剂量X射线对成骨细胞基因表达谱的影响及相关分子机制。MC3T3-E1细胞在低剂量X线照射后，继续诱导成骨培养7天，收集样本后采用罗氏NimbleGen小鼠表达谱芯片进行检测。经过RNA抽提纯化和完整性检测后，取5μgRNA进行标记杂交，GenePix Pro6.0软件扫描获取图像并应用NimbleScan2.5软件进行数据分析。应用T检验筛选出p<0.05，两组之间差异表达在1.3倍以上的基因为判定差异基因。结果显示，成骨细胞在低剂量X射线照射后，共发现1412个差异基因，其中559个上调，853个下调。差异基因中促进成骨细胞分化、钙化，及一些生长因子及受体基因上调，同时调控细胞外基质、局部粘附、细胞骨架和血管形成的基因也明显上调。GO和Pathway分析结果显示细胞粘附、细胞周期及调节、Wnt信号、NF-κB信号、细胞骨架、TGF-信号、血小板生长因子受体信号基因明显富集。由此可见，低剂量的X线辐照对成骨细胞的生物学效应的复杂性，其促进成骨细胞分化和矿化可能与细胞外基质-局部粘附-细胞骨架途径、Wnt信号通路及生长因子相关信号通路有关。三、0.5Gy X线照射通过Wnt/-Catenin信号通路促进成骨细胞分化为了进一步研究Wnt信号通路在0.5GyX线促进成骨细胞分化中扮演的重要作用，以明确0.5Gy X线照射促进成骨细胞分化的分子机制。成骨细胞接受0.5Gy线照射后流式细胞仪检测细胞凋亡，通过检测骨分化标志物Col1α、ALP、OCN基因蛋白表达水平及ALP活性染色评估成骨细胞分化情况，应用Real-time PCR及Western-blot检测Wnt信号通路中关键分子的表达情况，同时检测Wnt/-Catenin特异性抑制剂XAV939对0.5Gy X线促进成骨细胞分化效应的影响。结果显示，0.5Gy X线可以抑制MC3T3-E1细胞凋亡，照射后4天Col1α、ALP、OCN表达减少，而在分化的中、晚期表达有增加趋势。同时，0.5Gy X射线照射可以激活成骨细胞Wnt/GSK-3/-Catenin信号，应用特异性抑制剂XAV939可以消除0.5Gy X射线照射导致的ALP表达升高。因此，低剂量X线照射成骨细胞后早期可以促进细胞存活，及中、晚期骨性分化标志物表达水平增高，这与低剂量X线照射对成骨细胞Wnt信号的影响密切相关。四、TGF-1/Smad2、3信号通路在0.5Gy X射线促进成骨细胞分化过程的作用验证TGF-1/Smads通路在0.5Gy X线照射在促进成骨细胞增殖和分化过程的重要作用。克隆形成实验及细胞周期检测0.5Gy X线照射后成骨细胞的分裂增殖能力，同时评估X线照射对成骨细胞分化、矿化的影响。Real-time PCR检测X线照射后成骨细胞周期调控因子、TGF-1及受体ALK5的mRNA的表达水平，ELISA检测X线照射后TGF-1分泌活性，Western-blot检测TGF-1信号通路关键调控分子Smad2、3的表达水平。结果显示，0.5GyX线照射能增加成骨细胞克隆形成率及S+G2/M细胞比例，增加CyclinD1和Id2的mRNA表达水平，而且导致骨性标志物表达动态变化及促进成骨细胞分化、矿化，同时0.5GyX线照射可以激活TGF-1/Smad2、3信号通路。因此，低剂量X线照射可以促进成骨细胞增殖和表达骨分化相关基因，增加成骨细胞分化成熟、矿化及骨形成能力，在这一过程TGF-1/Smad2,3/Osterix通路可能参与了重要分子调控机制。五、IGF-1/Akt信号通路在0.5Gy X射线促成骨细胞分化过程的调控作用研究低剂量X线照射对成骨细胞IGF-1信号的影响，同时探讨IGF-1信号与Wnt信号、TGF-信号间的相互作用，以期深入阐述低剂量X线对成骨细胞的生物学效应及相关分子机制。首先构建IRS-1shRNA慢病毒载体，感染MC3T3-E1细胞后检测IRS-1基因沉默情况。成骨细胞在接受0.5GyX线照射后，Real-time PCR检测IGF-1及膜受体IGF-1R的mRNA表达水平，Western-blot检测IGF-1信号通路关键调控分子Akt的活性。通过RNA干扰阻断IGF-1/Akt信号通路，同时检测其对成骨细胞分化及Wnt/-Catenin和TGF-1/Smad2，3信号的影响。结果显示，成功构建了IRS-1shRNA慢病毒载体和建立了稳转细胞克隆。低剂量X线促进成骨细胞分化的同时可激活IGF-1/Akt信号通路，RNA干扰阻断IRS-1基因可抑制IGF-1/Akt信号，也可消除低剂量X线促进成骨细胞分化成熟及矿化的效应。在低剂量X线照后早期，IGF-1信号可以调节Wnt信号通路中关键分子GSK-3活性，而对TGF-1通路中Smad2的表达水平无显著影响。因此可以看出，0.5GyX线照射通过激活IGF-1/Akt信号通路促进成骨细胞分化和矿化过程。同时，IGF-1/Akt信号可能参与了Wnt信号及TGF-1信号的相互作用。