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目的:FG-4592（Roxadustat,罗沙司他）是一种新型HIF-脯氨酸羟化酶抑制剂,已被证明对急性肾损伤具有肾保护作用。然而,它在慢性肾脏疾病进展中的作用在很大程度上是未知的。本研究旨在评估FG-4592是否通过干预单侧输尿管梗阻（Unilateral ureteral obstruction,UUO）大鼠的坏死性炎症来减缓肾纤维化,对慢性肾脏病具有肾保护作用。方法:80只7周龄（体重240～250g）SPF级Sprague-Dawley雄性大鼠均自由饮水和进食,适应性喂养1周后大鼠随机分成10组（n=8/组）。行单侧输尿管结扎术前,大鼠禁食12小时,给予正常饮水。造模前分为假手术组（Sham group）和UUO模型组,其中UUO模型组采用分离大鼠左侧输尿管进行双结扎造模,Sham组只分离左侧输尿管后不结扎输尿管。在术前,UUO模型组的大鼠提前48小时给予灌胃FG-4592（10mg/kg/d）和/或腹腔注射Nec-1（2mg/kg/d）行预处理,UUO造模后继续治疗14天,并分别于7天、14天处死大鼠。（1）Sham7组:给予等量的生理盐水灌胃7天;（2）Sham14组:给予等量的生理盐水灌胃14天;（3）UUO7组:单侧输尿管结扎术后7天;（4）UUO14组:单侧输尿管结扎术后14天;（5）UUO7+FG组:单侧输尿管结扎并给予灌胃FG-4592（10mg/kg/d）7天;（6）UUO14+FG组:单侧输尿管结扎并给予灌胃FG-4592（10mg/kg/d）14天;（7）UUO7+Nec-1组:单侧输尿管结扎并给予腹腔注射Nec-1（2mg/kg/d）7天;（8）UUO14+Nec-1组:单侧输尿管结扎并给予腹腔注射Nec-1（2mg/kg/d）14天;（9）UUO7+FG+Nec-1组:单侧输尿管结扎并给予灌胃 FG-4592（10mg/kg/d）和 Nec-1 腹腔注射（2mg/kg/d）7 天;（10）UUO14+FG+Nec-1 组:单侧输尿管结扎并给予灌胃FG-4592（10mg/kg/d）和Nec-1腹腔注射（2mg/kg/d）14天。右侧颈内静脉采血,用全自动生化分析仪检测血肌酐（Serumcreatinine,Scr）及血尿素氮（Blood urea nitrogen,BUN）。采集肾组织标本,常规石蜡包埋和切片,Masson染色法观察肾间质纤维化（Tubulointerstitial fibrosis,TIF）程度,PAS染色观察肾小管组织损伤,使用电子显微镜观察肾组织的线粒体等超微结构变化。在分子水平上,免疫印迹法检测了RIP1-RIP3-MLKL 信号轴蛋白表达、IL-1β、IL-18 和 NLRP3 和促炎介质（MCP-1、TNF-α和TLR-2）的表达、检测肾小管间质纤维化相关致纤维因子TGF-β1和CTGF表达,从坏死性凋亡、NLRP3炎症体和促炎介质的角度评价了 FG-4592对UUO诱导的坏死性炎症的影响。检测了氧化应激相关蛋白SOD、MnSOD、NOX-2、NOX-4表达和血清及尿中8-OHdG表达水平,为明确对于内质网应激的影响检测了 CHOP、BiP、IRE-1α和ATF-6的表达,以及为明确对线粒体功能障碍的影响,检测了 TOMM20、NDUFA10、SDHA、DrP-1和OPA1,此外还检测了 Bcl-2/Bax 比值和活化型caspase-3蛋白以及HIF-1α/Wnt3α/β-catenin/GSK-3β信号传导通路相关蛋白的表达。结果:1.在分子水平上,RIP1-RIP3-MLKL信号轴蛋白在UUO肾脏组织中的表达逐渐增加,FG-4592和Nec-1治疗后均可减少RIP1-RIP3-MLKL信号轴蛋白表达,且FG-4592和Nec-1联合治疗组中相关蛋白减少更加显著。电镜下可见UUO肾组织的肾小管上皮细胞聚集坏死、肿胀、上皮细胞微绒毛脱落、细胞溶解。2.UUO7 或 UUO14 组中明显上调了 IL-1β、IL-18 和 NLRP3 和促炎介质（MCP-1、TNF-α和TLR-2）的表达,而FG-4592和Nec-1均可逆转这种表达,且FG-4592和Nec-1联合治疗组中相关蛋白减少更加显著。3.UUO7或UUO14组TIF增加明显,使用FG-4592或Nec-1治疗的UUO7、UUO14组的纤维化评分增加明显减少,而联合使用FG-4592和Nec-1组则进一步明显降低。免疫印记分析表明,与UUO组相比,FG-4592或Nec-1处理后明显抑制了致纤因子TGF-1和CTGF的表达,且呈时间依赖性。4.FG-4592预处理后上调了 SOD1和MnSOD蛋白的表达,而下调了 NOX-2和NOX-4蛋白的表达,提示通过保持氧化酶和抗氧化酶平衡抑制UUO引起的氧化应激。此外,通过氧化应激标志物8-OHdG在血清和尿液中的浓度在UUO7组高于Sham组,在UUO14组最高,而给予FG-4592的UUO组血清和尿液中8-OHdG的浓度则低于Sham组,而联合给予FG-4592及Nec-1的UUO组血清和尿液中的8-OHdG的显著下降等,再次确认了 UUO引起肾损伤与氧化应激密切相关,且FG-4592可逆转UUO引起的氧化应激效应。5.电镜下观察到UUO肾组织的粗面内质网核糖体脱颗粒、囊腔断开、扩张、囊泡化变性,以及过氧化物酶体空泡化变性,而滑面内质网几乎保持正常结构。免疫印迹分析显示,与形态学结果相一致,免疫印迹分析提示UUO明显上调内质网应激相关基因的表达,呈时间依赖性,包括CHOP、Bip、IRE-1α和ATF-6,但FG-4592治疗在观察的两个时间点均明显减少了它们的表达。6.电镜清楚地显示,UUO肾组织中被破坏的线粒体结构,表现为线粒体数量显著减少,空泡变性、嵴扩张,线粒体融合（fusion）,线粒体自噬（mitophagy）,线粒体分裂（fission）两个或三个以上的子细胞器。免疫印迹分析显示,与Sham组相比,UUO肾组织中TOMM20、NDUFA10和SDHA的表达明显受到抑制,而FG-4592预处理可逆转其蛋白的表达。此外,FG-4592明显降低了 DrP-1（裂变蛋白）的表达,但增加了 OPA1（融合蛋白）的表达。7.TUNEL阳性细胞定量计数显示,UUO组TUNEL阳性细胞数增加,:FG-4592治疗组在UUO第7天和第14天均明显减少了 TUNEL阳性细胞数。免疫印迹分析显示,给予FG-4592预处理的UUO组大鼠可显著调节Bcl-2/Bax 比值,并恢复活化型caspase-3蛋白的表达以利于细胞的生存。8.UUO以时间依赖的方式诱导Wnt3α/β-catenin/GSK-3β的激活,而FG-4592处理可抑制其表达。结论:1.UUO可引起RIP1-RIP3-MLKL相关蛋白过度表达,同时引发细胞焦亡、坏死性炎症以及肾纤维化,呈时间依赖性。2.坏死性炎症与氧化应激所致线粒体功能障碍、内质网应激和细胞凋亡紧密相关。3.上述改变均被FG-4592或RIP1抑制剂Nec-1所逆转,说明FG-4592通过抑制RIP1-RIP3-MLKL诱导的坏死性炎症从而改善UUO肾纤维化。4.FG-4592的抗纤维化作用可能是通过干预HIF-1α/Wnt/catenin/GSK信号通路而完成。